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E型肉毒神經(jīng)毒素重組Hc-C亞單位疫苗免疫原性研究

發(fā)布時(shí)間:2020-12-10 00:33
  目的利用大腸桿菌高效表達(dá)并純化E型肉毒神經(jīng)毒素(BoNT/E)受體結(jié)合區(qū)Hc的亞結(jié)構(gòu)域EHc-C蛋白,并進(jìn)行免疫原性研究。方法利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出EHc-C基因,克隆于載體pTIG-Trx-His-tag中得到重組質(zhì)粒pTIG-Trx-EHc-C,轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,超聲破碎菌體,收集上清,經(jīng)鎳柱親和純化獲得重組抗原EHc-C蛋白,通過SDS-PAGE和Western印跡檢測純化效果,之后免疫BALB/c小鼠,評價(jià)其免疫原性。結(jié)果通過原核表達(dá)純化獲得了純度>90%的重組抗原EHc-C蛋白,該重組抗原作為亞單位疫苗免疫小鼠產(chǎn)生了特異性抗體反應(yīng),10μg劑量抗原蛋白3次免疫小鼠即可抵抗104LD50E型肉毒毒素攻擊,血清中和抗體效價(jià)可達(dá)1.00 U/ml。結(jié)論獲得的重組EHc-C抗原免疫原性良好,免疫小鼠后能抵抗E型肉毒毒素的攻擊,產(chǎn)生強(qiáng)烈保護(hù)作用,可作為亞單位候選疫苗預(yù)防E型肉毒毒素中毒或用于研究肉毒毒素疫苗和抗體的功能表位。 

【文章來源】:軍事醫(yī)學(xué). 2019年05期 第346-351頁 北大核心

【文章頁數(shù)】:6 頁

【部分圖文】:

E型肉毒神經(jīng)毒素重組Hc-C亞單位疫苗免疫原性研究


pTIG-Trx-EHc-C菌落PCR鑒定圖

蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量,標(biāo)志物,誘導(dǎo)表達(dá)


軍事醫(yī)學(xué)2019年5月第43卷第5期MilMedSci,Vol43,No5,May,2019柱對重組EHcC蛋白進(jìn)行純化,經(jīng)SDSPAGE檢測純化得到的蛋白符合目的蛋白的理論大小,且咪唑濃度為100mmol/L時(shí)純度達(dá)到了電泳級。Western印跡證實(shí)該重組EHcC能特異性與抗EHc血清抗體、抗E型毒素的抗體結(jié)合,具有E型毒素的抗原性(圖3)。圖2EHc-C誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE檢測M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)志物;1.未加IPTG誘導(dǎo)對照;2.包涵體;3.誘導(dǎo)表達(dá)破菌上清;4.誘導(dǎo)表達(dá)全菌圖3EHc-C純化后SDS-PAGE和Western印跡鑒定M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)志物;1.誘導(dǎo)表達(dá)破菌上清;2.100mmol/L咪唑洗脫的目的蛋白;3.穿過液;4.脫鹽蛋白;5,6.Western印跡檢測表達(dá)純化產(chǎn)物:5.一抗為抗EHc抗體;6.一抗為抗E型毒素的抗體22.2重組亞單位疫苗免疫小鼠后體液免疫反應(yīng)的測定采用ELISA方法檢測免疫后小鼠血清中的體液免疫反應(yīng),第3次免疫后較第2次的抗體水平迅速增強(qiáng),陰性對照組的抗體水平無變化(圖4),表明此重組抗原免疫原性良好;抗體滴度的結(jié)果表明,EHcC抗原免疫組第2次免疫抗體滴度的平均值為1∶3200,最高滴度為1∶6400;第3次免疫抗體滴度平均值為1∶307200,最高滴度為1∶409600(圖5),相對于第2次免疫的抗體滴度,第3次有明顯的增強(qiáng),該重組抗原作為亞單位疫苗免疫小鼠后產(chǎn)生了特異性抗體反應(yīng);此外,還對免疫后小鼠產(chǎn)生的抗體亞型進(jìn)行了測定,抗原EHcC免疫小鼠后產(chǎn)生的特異性抗體主要為IgG1(圖6),即提示此抗原免疫小鼠后產(chǎn)生的抗體反應(yīng)更傾向于Th2

蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量,標(biāo)志物


?2019年5月第43卷第5期MilMedSci,Vol43,No5,May,2019柱對重組EHcC蛋白進(jìn)行純化,經(jīng)SDSPAGE檢測純化得到的蛋白符合目的蛋白的理論大小,且咪唑濃度為100mmol/L時(shí)純度達(dá)到了電泳級。Western印跡證實(shí)該重組EHcC能特異性與抗EHc血清抗體、抗E型毒素的抗體結(jié)合,具有E型毒素的抗原性(圖3)。圖2EHc-C誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE檢測M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)志物;1.未加IPTG誘導(dǎo)對照;2.包涵體;3.誘導(dǎo)表達(dá)破菌上清;4.誘導(dǎo)表達(dá)全菌圖3EHc-C純化后SDS-PAGE和Western印跡鑒定M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)志物;1.誘導(dǎo)表達(dá)破菌上清;2.100mmol/L咪唑洗脫的目的蛋白;3.穿過液;4.脫鹽蛋白;5,6.Western印跡檢測表達(dá)純化產(chǎn)物:5.一抗為抗EHc抗體;6.一抗為抗E型毒素的抗體22.2重組亞單位疫苗免疫小鼠后體液免疫反應(yīng)的測定采用ELISA方法檢測免疫后小鼠血清中的體液免疫反應(yīng),第3次免疫后較第2次的抗體水平迅速增強(qiáng),陰性對照組的抗體水平無變化(圖4),表明此重組抗原免疫原性良好;抗體滴度的結(jié)果表明,EHcC抗原免疫組第2次免疫抗體滴度的平均值為1∶3200,最高滴度為1∶6400;第3次免疫抗體滴度平均值為1∶307200,最高滴度為1∶409600(圖5),相對于第2次免疫的抗體滴度,第3次有明顯的增強(qiáng),該重組抗原作為亞單位疫苗免疫小鼠后產(chǎn)生了特異性抗體反應(yīng);此外,還對免疫后小鼠產(chǎn)生的抗體亞型進(jìn)行了測定,抗原EHcC免疫小鼠后產(chǎn)生的特異性抗體主要為IgG1(圖6),即提示此抗原免疫小鼠后產(chǎn)生的抗體反應(yīng)更傾向于Th2型免?


本文編號:2907750

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