目的構(gòu)建人包皮成纖維細(xì)胞（HFF）酵母雙雜交均一化cDNA文庫,為研究弓形蟲與宿主細(xì)胞間的相互作用及其入侵機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法復(fù)蘇、培養(yǎng)HFF細(xì)胞并提取細(xì)胞總RNA,采用SMART和LD-PCR合成ds cDNA,對其進(jìn)行均一化處理后,利用SfiI酶切,酶切后的ds cDNA連接pGADT7-SfiI三閱讀框表達(dá)載體,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌HST08,構(gòu)建cDNA初級文庫,進(jìn)行庫容檢測和插入片段的PCR鑒定。提取文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至酵母Y187中,制備HFF細(xì)胞Y187酵母文庫。結(jié)果 HFF細(xì)胞總RNA的A260/A280值為2.02,1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測到28S和18S核糖體特異性條帶且二者亮度之比為2∶1,提取的RNA完整、質(zhì)量良好。3種讀碼框庫容分別為1.4×10⁶ CFU/ml、1.8×10⁶ CFU/ml和2.0×10⁶ CFU/ml,重組率為99%。cDNA文庫外源基因插入片段長度700～2 000bp。制備的HFF細(xì)胞酵母cDNA文庫庫容量為2.5×10⁷ CFU/ml。結(jié)論構(gòu)建的HF... 

【文章來源】：中國病原生物學(xué)雜志. 2019年01期 第23-26頁 北大核心

【文章頁數(shù)】：4 頁

【部分圖文】：

圖１ＨＦＦ細(xì)胞總ＲＮＡ１．５％瓊脂糖凝膠電泳Ｍ２５０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１ＴｏｔａｌＲＮＡｏｆＨＦＦｃｅｌｌＭ２５０ｂｐＤＮＡ標(biāo)志物１ＨＦＦ細(xì)胞總ＲＮＡ

勻彌散，且濃度提高（圖２Ｂ）。Ｍ２５０ｂｐＤＮＡ標(biāo)志物１ＨＦＦ細(xì)胞總ＲＮＡ圖１ＨＦＦ細(xì)胞總ＲＮＡ１．５％瓊脂糖凝膠電泳Ｍ２５０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１ＴｏｔａｌＲＮＡｏｆＨＦＦｃｅｌｌＦｉｇ．１ＴｏｔａｌＲＮＡｏｆＨＦＦｃｅｌｌＭ２５０ｂｐＤＮＡ標(biāo)志物１ｃＤＮＡ２均一化的ｃＤＮＡ圖２ｃＤＮＡ合成及均一化電泳圖Ｍ２５０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１ｃＤＮＡ２ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｃＤＮＡＦｉｇ．２ＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｏｆｃＤＮＡａｎｄｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｃＤＮＡ３ｃＤＮＡＳｆｉＩ酶切及純化ｃＤＮＡ經(jīng)過限制性內(nèi)切酶ＳｆｉＩ酶切處理后，使用ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥ對酶切ｃＤＮＡ進(jìn)行過柱處理，去除短片段，１．５％瓊脂糖凝膠電泳顯示彌散狀的ｃＤＮＡ均勻分布在５００～３０００ｂｐ處（圖３），短片段得到有效去除。Ｍ２５０ｂｐＤＮＡ標(biāo)志物１ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥ純化后的ｃＤＮＡ圖３ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥ純化ｃＤＮＡ的電泳分析Ｍ２５０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｃＤＮＡｗｉｔｈＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥＦｉｇ．３ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｃＤＮＡｗｉｔｈＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥ４初級文庫庫容檢測酶切、純化后的ｃＤＮＡ與ｐＧＡＤＴ７－ＳｆｉＩ三框表達(dá)載體連接、轉(zhuǎn)化后，計算文庫庫容，３種讀碼框庫容分別為１．４×１０６ＣＦＵ／ｍｌ、１．８×１０６ＣＦＵ／ｍｌ和２．０×１

勻彌散，且濃度提高（圖２Ｂ）。Ｍ２５０ｂｐＤＮＡ標(biāo)志物１ＨＦＦ細(xì)胞總ＲＮＡ圖１ＨＦＦ細(xì)胞總ＲＮＡ１．５％瓊脂糖凝膠電泳Ｍ２５０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１ＴｏｔａｌＲＮＡｏｆＨＦＦｃｅｌｌＦｉｇ．１ＴｏｔａｌＲＮＡｏｆＨＦＦｃｅｌｌＭ２５０ｂｐＤＮＡ標(biāo)志物１ｃＤＮＡ２均一化的ｃＤＮＡ圖２ｃＤＮＡ合成及均一化電泳圖Ｍ２５０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１ｃＤＮＡ２ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｃＤＮＡＦｉｇ．２ＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｏｆｃＤＮＡａｎｄｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｃＤＮＡ３ｃＤＮＡＳｆｉＩ酶切及純化ｃＤＮＡ經(jīng)過限制性內(nèi)切酶ＳｆｉＩ酶切處理后，使用ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥ對酶切ｃＤＮＡ進(jìn)行過柱處理，去除短片段，１．５％瓊脂糖凝膠電泳顯示彌散狀的ｃＤＮＡ均勻分布在５００～３０００ｂｐ處（圖３），短片段得到有效去除。Ｍ２５０ｂｐＤＮＡ標(biāo)志物１ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥ純化后的ｃＤＮＡ圖３ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥ純化ｃＤＮＡ的電泳分析Ｍ２５０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｃＤＮＡｗｉｔｈＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥＦｉｇ．３ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｃＤＮＡｗｉｔｈＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥ４初級文庫庫容檢測酶切、純化后的ｃＤＮＡ與ｐＧＡＤＴ７－ＳｆｉＩ三框表達(dá)載體連接、轉(zhuǎn)化后，計算文庫庫容，３種讀碼框庫容分別為１．４×１０６ＣＦＵ／ｍｌ、１．８×１０６ＣＦＵ／ｍｌ和２．０×１

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建[J]. 薛進(jìn),李靜,羊健,唐彥,梁瑤,陳劍平,張恒木.  浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報. 2017(12)
[2]滅蚊真菌-貴陽腐霉Pythium sp.GY1938菌株cDNA文庫的構(gòu)建及鑒定[J]. 楊平,李艷,張坤,余赟,楊亞瓊,黃世梅,李敏惠.  中國病原生物學(xué)雜志. 2017(03)

博士論文
[1]與弓形蟲微線體蛋白互作的宿主蛋白的篩選和鑒定[D]. 王一凡.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015



本文編號：2907211