混合血小板裂解液對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)、增殖和成骨分化的影響
發(fā)布時(shí)間：2020-12-08 14:12
目的研究混合血小板裂解液(pHPL)對(duì)體外培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMMSCs)原代培養(yǎng)、增殖和成骨分化的影響。方法使用臨床過期的多份濃縮血小板混合,多次凍融激活后制備pHPL,分別使用胎牛血清(FBS)和pHPL加基礎(chǔ)培養(yǎng)液原代培養(yǎng)hBMMSCs,比較兩組中的細(xì)胞形態(tài)、表面標(biāo)志物、細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期和增殖率,并在加入經(jīng)典成骨誘導(dǎo)液后檢測(cè)兩組中堿性磷酸酶含量、成骨相關(guān)基因含量和礦化結(jié)節(jié)形成,比較其成骨分化能力。結(jié)果 FBS和pHPL培養(yǎng)組均能較好地支持hBMMSCs的原代培養(yǎng),兩組中細(xì)胞形態(tài)、表面標(biāo)志物、細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期均無明顯差異,但pHPL組在5、7 d時(shí)的細(xì)胞增殖率明顯高于FBS組(P<0.05);在成骨誘導(dǎo)后,pHPL組中堿性磷酸酶含量、成骨相關(guān)基因含量也明顯高于FBS組(P<0.05),兩組中細(xì)胞均可以形成成熟的礦化結(jié)節(jié)。結(jié)論 pHPL能夠很好支持hBMMSCs的原代培養(yǎng)、增殖和成骨分化,且較FBS能更好地促進(jìn)其增殖和成骨分化。
【文章來源】：中國當(dāng)代醫(yī)藥. 2019年18期 第13-18頁
【文章頁數(shù)】：6 頁
【部分圖文】：
圖1兩組第二代細(xì)胞培養(yǎng)7d（100×）
狀物質(zhì)。8~10d左右A組和B組均出現(xiàn)細(xì)胞聚集形成的致密細(xì)胞結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)中心致密，透光性差，而周圍細(xì)胞呈放射狀分布，隨培養(yǎng)時(shí)間延長細(xì)胞結(jié)節(jié)的數(shù)量逐漸增加。AB圖1兩組第二代細(xì)胞培養(yǎng)7d（100×）2.2兩組hBMMSCs表面標(biāo)志物檢測(cè)情況的比較流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，所獲得的hBMMSCs純度較高，細(xì)胞一致性好。其中CD29、CD44、CD105的表達(dá)均為陽性，而CD14、CD90均為陰性表達(dá)，兩組間表面標(biāo)志物檢測(cè)無明顯差異（圖2）。2.3兩組細(xì)胞骨架免疫熒光染色情況的比較免疫熒光染色顯示，兩組hBMMSCs均具有良好的微管微絲系統(tǒng)（圖3），提示兩種培養(yǎng)條件下細(xì)胞均可以正常生長且具有良好功能。ImageJ軟件測(cè)量A組細(xì)胞長寬比為2.17±0.65，B組為2.30±0.58，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.575，P=0.572）。RUNX2ALPCOL-IOCGAPDHForward:5′-TCCAACCCACGAATGCACTA-3′Reverse:5′-GAAGGGTCCACTCTGGCTTTG-3′Forward:5′-GTCACTGCGGACCATTCC-3′Reverse:5′-GGCTGCATACGCCATCAC-3′Forward:5′-AGGTGTTGTGCGATGACG-3′Reverse:5′-CTCATCATAGCCATAAGAC-3′Forward:5′-CAGCCACCGAGACACCATG-3′Reverse:5′-CAGAGCGACACCCTAGACC-3′Forward:5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′Reverse:5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′基因引物序列圖2hBMMSCs的表面標(biāo)志物AB15
·論著·中國當(dāng)代醫(yī)藥2019年6月第26卷第18期CHINAMODERNMEDICINEVol.26No.18June2019AB圖3兩組中hBMMSCs的細(xì)胞骨架（200×）2.4兩組細(xì)胞周期的比較A、B兩組中hBMMSCs均有90%左右處于G0/G1期，顯示大部分細(xì)胞均處于靜止期，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖4）。圖4兩組中hBMMSCs的細(xì)胞周期2.5兩組細(xì)胞增殖率的比較兩組中hBMMSCs均可以快速增殖，并在約5~7d時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期。B組在5、7d時(shí)的細(xì)胞增殖率高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。提示pHPL促進(jìn)hBMMSCs增殖的效果較FBS更強(qiáng)。表2兩組細(xì)胞增殖率的比較（OD值，x±s）2.6兩組ALP水平的比較加入成骨誘導(dǎo)液后，兩組中ALP含量均逐漸上升，并在第10天左右達(dá)到高峰，但B組中ALP含量在2、6、10、14d時(shí)均高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表3）。表3兩組ALP水平的比較（mmol/L，x±s）2.7兩組成骨相關(guān)基因檢測(cè)情況的比較經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，將A組的數(shù)據(jù)作為1，測(cè)得B組的平均相對(duì)含量，結(jié)果顯示，B組中成骨相關(guān)基因RUNX2、ALP、COLI、OC表達(dá)水平均高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表4）。表4熒光定量PCR結(jié)果（2-△△Ct）2.8兩組的礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色情況兩組細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后均可見到染色的成熟礦化結(jié)節(jié)形成（圖5）。圖5兩組中礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色（100×）3討論間充質(zhì)干細(xì)胞（humanmesenchymalstemcells，hM-SCs）具有良好的體外擴(kuò)增能力和多向分化潛能，是最有希望應(yīng)用于臨床干細(xì)胞治療的成體干細(xì)胞，也是組織工程研究中最有前景的種子細(xì)胞之一[3]，骨髓來源的hBMMSCs則是相對(duì)最容易獲得的hMSCs[4]。但成人組織中干細(xì)胞數(shù)量極其有限，為了獲得足夠用于臨床應(yīng)用的細(xì)胞量，需要對(duì)其進(jìn)行體外擴(kuò)增，多數(shù)情況下?
本文編號(hào)：2905220
【文章來源】：中國當(dāng)代醫(yī)藥. 2019年18期 第13-18頁
【文章頁數(shù)】：6 頁
【部分圖文】：
圖1兩組第二代細(xì)胞培養(yǎng)7d（100×）
狀物質(zhì)。8~10d左右A組和B組均出現(xiàn)細(xì)胞聚集形成的致密細(xì)胞結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)中心致密，透光性差，而周圍細(xì)胞呈放射狀分布，隨培養(yǎng)時(shí)間延長細(xì)胞結(jié)節(jié)的數(shù)量逐漸增加。AB圖1兩組第二代細(xì)胞培養(yǎng)7d（100×）2.2兩組hBMMSCs表面標(biāo)志物檢測(cè)情況的比較流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，所獲得的hBMMSCs純度較高，細(xì)胞一致性好。其中CD29、CD44、CD105的表達(dá)均為陽性，而CD14、CD90均為陰性表達(dá)，兩組間表面標(biāo)志物檢測(cè)無明顯差異（圖2）。2.3兩組細(xì)胞骨架免疫熒光染色情況的比較免疫熒光染色顯示，兩組hBMMSCs均具有良好的微管微絲系統(tǒng)（圖3），提示兩種培養(yǎng)條件下細(xì)胞均可以正常生長且具有良好功能。ImageJ軟件測(cè)量A組細(xì)胞長寬比為2.17±0.65，B組為2.30±0.58，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.575，P=0.572）。RUNX2ALPCOL-IOCGAPDHForward:5′-TCCAACCCACGAATGCACTA-3′Reverse:5′-GAAGGGTCCACTCTGGCTTTG-3′Forward:5′-GTCACTGCGGACCATTCC-3′Reverse:5′-GGCTGCATACGCCATCAC-3′Forward:5′-AGGTGTTGTGCGATGACG-3′Reverse:5′-CTCATCATAGCCATAAGAC-3′Forward:5′-CAGCCACCGAGACACCATG-3′Reverse:5′-CAGAGCGACACCCTAGACC-3′Forward:5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′Reverse:5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′基因引物序列圖2hBMMSCs的表面標(biāo)志物AB15
·論著·中國當(dāng)代醫(yī)藥2019年6月第26卷第18期CHINAMODERNMEDICINEVol.26No.18June2019AB圖3兩組中hBMMSCs的細(xì)胞骨架（200×）2.4兩組細(xì)胞周期的比較A、B兩組中hBMMSCs均有90%左右處于G0/G1期，顯示大部分細(xì)胞均處于靜止期，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖4）。圖4兩組中hBMMSCs的細(xì)胞周期2.5兩組細(xì)胞增殖率的比較兩組中hBMMSCs均可以快速增殖，并在約5~7d時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期。B組在5、7d時(shí)的細(xì)胞增殖率高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。提示pHPL促進(jìn)hBMMSCs增殖的效果較FBS更強(qiáng)。表2兩組細(xì)胞增殖率的比較（OD值，x±s）2.6兩組ALP水平的比較加入成骨誘導(dǎo)液后，兩組中ALP含量均逐漸上升，并在第10天左右達(dá)到高峰，但B組中ALP含量在2、6、10、14d時(shí)均高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表3）。表3兩組ALP水平的比較（mmol/L，x±s）2.7兩組成骨相關(guān)基因檢測(cè)情況的比較經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，將A組的數(shù)據(jù)作為1，測(cè)得B組的平均相對(duì)含量，結(jié)果顯示，B組中成骨相關(guān)基因RUNX2、ALP、COLI、OC表達(dá)水平均高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表4）。表4熒光定量PCR結(jié)果（2-△△Ct）2.8兩組的礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色情況兩組細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后均可見到染色的成熟礦化結(jié)節(jié)形成（圖5）。圖5兩組中礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色（100×）3討論間充質(zhì)干細(xì)胞（humanmesenchymalstemcells，hM-SCs）具有良好的體外擴(kuò)增能力和多向分化潛能，是最有希望應(yīng)用于臨床干細(xì)胞治療的成體干細(xì)胞，也是組織工程研究中最有前景的種子細(xì)胞之一[3]，骨髓來源的hBMMSCs則是相對(duì)最容易獲得的hMSCs[4]。但成人組織中干細(xì)胞數(shù)量極其有限，為了獲得足夠用于臨床應(yīng)用的細(xì)胞量，需要對(duì)其進(jìn)行體外擴(kuò)增，多數(shù)情況下?
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