發(fā)布時(shí)間：2020-12-07 19:44

　　由人類(lèi)免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）感染所引起的艾滋病（Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS）對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，研究一種快速有效的適合國(guó)內(nèi)HIV病毒感染的檢測(cè)手段，尤為重要。 HIV-1 pol基因主要編碼P66，P51。HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）分子由2個(gè)亞基組成（5.1×10⁴kd和6.6×10⁴kd），RT是由pol基因編碼以一種多蛋白的形式表達(dá)，通常在感染細(xì)胞中微量存在。在病毒中，HIV-1 RT以?xún)上嚓P(guān)多肽p66和p51亞單位二聚體出現(xiàn)，分子比例為1∶1。P51亞單位是p66亞單位C端裂解而來(lái)。p66亞單位由兩催化活性結(jié)構(gòu)域，聚合酶，RNase H區(qū)域組成。在異源二聚體HIV-1 RT中p51僅僅包括聚合酶結(jié)構(gòu)域，不具有催化活性。 由于HIV的高度變異性，HIV pol基因表達(dá)產(chǎn)物誘導(dǎo)的廣泛交叉的細(xì)胞免疫反應(yīng)對(duì)于研制預(yù)防和治療性HIV疫苗都具有十分重要的意義，pol基因成為越來(lái)越多的HIV疫苗的重要組分，定量檢測(cè)Pol抗... 

【文章來(lái)源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：100 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
Part Ⅰ
    摘要
    Abstract
    前言
    1 HIV簡(jiǎn)介
    2 HIV-1基因組結(jié)構(gòu)及功能
    3 HIV-1 pol基因編碼產(chǎn)物功能及相互作用
    4 HIV-1 pol特異的抗原表位
    5 HIV-1 pol作為抗原在HIV-1檢測(cè)與治療中的作用與地位
    6 本研究的內(nèi)容、目的與意義
    材料與方法
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 菌株與質(zhì)粒
        1.2 工具酶和主要生化試劑
        1.3 試劑盒
        1.4 主要儀器
        1.5 引物和抗體
    2 方法
        2.1 目的基因擴(kuò)增、克隆及測(cè)序
        2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3 細(xì)菌的培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)
        2.4 重組蛋白免疫印跡法鑒定
        2.5 包涵體的分離、提純
        2.6 包涵體的復(fù)性
        2.7 包涵體復(fù)性后的純化
    3 結(jié)果與分析
        3.1 目的基因擴(kuò)增
        3.2 表達(dá)載體鑒定
        3.3 重組蛋白P66和P51的表達(dá)
        3.4 重組蛋白P66和P51的免疫印跡
        3.5 重組蛋白P66和P51的復(fù)性與純化
    4 討論
    5 小結(jié)
    6 參考文獻(xiàn)
Part Ⅱ
    摘要
    Abstract
    前言
    1 DNA疫苗的特點(diǎn)
    2 DNA疫苗的免疫機(jī)制
    3 免疫佐劑在DNA疫苗中的應(yīng)用
    4 IL-12與IL-23的研究進(jìn)展
        4.1 IL-12結(jié)構(gòu)與功能概述與研究進(jìn)展
        4.2 IL-23結(jié)構(gòu)與功能概述與研究進(jìn)展
    5 本研究的內(nèi)容、目的及意義
    材料和方法
    1 材料
        1.1.1 工具酶
        1.1.2 試劑盒
        1.1.3 質(zhì)粒和菌株
        1.1.4 主要生化試劑
        1.1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        1.1.6 主要儀器
        1.1.7 常用溶液配方
        1.1.8 引物
    2 方法
        1.2.1 mIL-12和mIL-23 cDNA的擴(kuò)增
            1.2.1.1 p40、p35、p19 mRNA逆轉(zhuǎn)錄
            1.2.1.2 Nest-PCR法擴(kuò)增目的基因p40，p35，p19的cDNA
        1.2.2 mIL-12和mIL-23的TA克隆與測(cè)序
        1.2.3 mIL-12和mIL-23單亞基真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        1.2.4 mIL-12和mIL-23雙亞基真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        1.2.5 p40、p35、p19基因終止突變及突變克隆的構(gòu)建
            1.2.5.1 p40、p35、p19基因終止突變
            1.2.5.2 突變克隆的構(gòu)建
        1.2.6 mIL-12和mIL-23在2937細(xì)胞中的表達(dá)
            1.2.6.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            1.2.6.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
            1.2.6.3 Western blot測(cè)IL-12和IL-23在293T細(xì)胞中的表達(dá)
        1.2.7 免疫質(zhì)粒的大量提取
        1.2.8 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
            1.2.8.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組
            1.2.8.2 動(dòng)物免疫方案
        1.2.9 免疫指標(biāo)檢測(cè)
            1.2.9.1 小鼠的處理（小鼠脾淋巴細(xì)胞的制備）
            1.2.9.2 流式細(xì)胞儀測(cè)IFN-γ胞內(nèi)分泌
                1.2.9.2.1 細(xì)胞處理
                1.2.9.2.2 細(xì)胞染色
            1.2.9.3 ELISPOT測(cè)IFN-γ胞內(nèi)分泌
                1.2.9.3.1 包板
                1.2.9.3.2 細(xì)胞處理
                1.2.9.3.3 轉(zhuǎn)板處理
    3 結(jié)果與分析
        3.1 mIL-12和mIL-23 cDNA的擴(kuò)增
        3.2 mIL-12和mIL-23的TA克隆與測(cè)序
        3.3 mIL-12和mIL-23單亞基真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.4 mIL-12和mIL-23雙亞基真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.5 mIL-12和mIL-23在293T細(xì)胞中的表達(dá)
    4 討論
    5 小結(jié)
    6 參考文獻(xiàn)
致謝
附錄
    1 HIV-1 pol p66 sequence
    2 HIV-1 pol p51 sequence
    3 mIL-12 p40 sequence
    4 mIL-12 p40 mut sequence
    5 mIL-12 p35 sequence
    6 mIL-12 p35 mut sequence
    7 mIL-23 p19 sequence
    8 mIL-23 p19 mut sequence
    9 pDRSV1.0 sequence
    10 pDRSV40 sequence
    11 pDRSV40 mut sequence
    12 pDRSV35 sequence
    13 pDRSV19 sequence
    14 pDRSV19 mut sequence
    15 pDRSV3540 sequence
    16 pDRSV1940 sequence
+40^- sequence">    17 pDRSV19⁺40^- sequence
-40⁺ sequence">    18 pDRSV19^-40⁺ sequence
-40^- sequence">    19 pDRSV19^-40^- sequence
縮略詞表



本文編號(hào)：2903802