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甲型H7N9流感病毒NS1蛋白真核表達載體的構(gòu)建與表達

發(fā)布時間:2020-11-18 22:22
   本試驗旨在構(gòu)建甲型H7N9流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1)真核表達載體,并在293T細胞中表達其編碼的NS1蛋白。首先提取安徽分離株甲型H7N9流感病毒(A/Anhui/3/2013(H7N9))的總RNA,通過RT-PCR技術(shù)獲得了甲型H7N9流感病毒H7N9 NS1全長基因,然后將其克隆至載體pcDNA4-Flag-HA中構(gòu)建pcDNA4-Flag-HA-NS1真核重組表達載體,經(jīng)酶切及測序鑒定正確后將質(zhì)粒pcDNA4-Flag-HA-NS1轉(zhuǎn)染到293T細胞中,通過Western blotting鑒定NS1蛋白的表達。結(jié)果表明成功克隆了NS1全長基因,構(gòu)建了甲型H7N9流感病毒NS1蛋白真核表達載pcDNA4-Flag-HA-NS1,并在293T細胞中轉(zhuǎn)染表達,Western blotting確定了NS1蛋白的成功表達。該表達載體的成功構(gòu)建及在293T細胞中成功表達NS1蛋白,為后期開展流感病毒NS1蛋白功能及與真核細胞中的蛋白相互作用奠定了基礎(chǔ)。
【部分圖文】:

電泳圖,真核表達載體,電泳圖


提取質(zhì)粒。經(jīng)AscⅠ和FseⅠ雙酶切,進行1%瓊脂糖凝膠電泳,獲得大小為658bp的目的條帶(圖3),與預(yù)期結(jié)果相符,結(jié)果表明重組質(zhì)粒pMD18-T-NS1構(gòu)建成功。2.3pcDNA4-Flag-HA-NS1酶切鑒定取連接產(chǎn)物pcDNA4-Flag-HA-NS15μL,采用化學轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細胞。挑取單克隆搖菌,提取質(zhì)粒,然后用AscⅠ和FseⅠ雙酶切,進行1%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示有大小約658bp目的條帶(圖4)。將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送北京六合華大基因科技股份有限公司進行DNA測序,測序序列發(fā)到NCBI/GenBank數(shù)據(jù)庫上進行BLAST比對分析,結(jié)果顯示與已發(fā)表的NS1基因序列核苷酸同源性為99%,氨基酸同源性為98%。結(jié)果表明真核表達載體pcDNA4-Flag-HA-NS1構(gòu)建成功。圖2重組質(zhì)粒pMD18-T-NS1PCR鑒定電泳圖注:M,DL2000DNAMarker;1~4,單克;5,陰性對照。圖3重組質(zhì)粒pMD18-T-NS1雙酶切鑒定電泳圖注:1,DL2000DNAMarker;3,pMD18-T-NS1雙酶切結(jié)果。圖4真核表達載體pcDNA4-Flag-HA-NS1雙酶切鑒定電泳圖注:M,DL2000DNAMarker;1,pcDNA4-Flag-HA-NS1雙酶切結(jié)果。2.4Westernblotting鑒定結(jié)果轉(zhuǎn)染pcDNA4-Flag-HA-NS1的293T細胞表達的重組蛋白可被Flag抗體識別,其大小

流感病毒,蛋白,甲型,宿主細胞


條帶(圖5),結(jié)果表明NS1在293T細胞中得到表達。圖5Westernblotting檢測pcDNA4-Flag-HA-NS1在293T細胞中的表達注:1,pcDNA4-Flag-HA-NS1;2,pcDNA4-Flag-HA空載體。3討論2013年甲型H7N9流感病毒被專家確認為全球首發(fā)的新亞型流感病毒,因其極易被人忽略的流感癥狀、高死亡率和快速的傳染性,引起高度重視。此次甲型流感致病性和傳播速度變化很可能與NS1蛋白與其宿主相互作用蛋白不同有關(guān),使人們對NS1蛋白的研究也更加深入。NS1蛋白只在病毒侵入機體細胞后才生成,暗示NS1蛋白可能在破壞被感染細胞的過程中扮演著一個關(guān)鍵的角色,對流感病毒的毒性起非常重要的作用。針對目前已報道的甲型H7N9流感病毒,用DNAMAN軟件將其和其他地區(qū)的甲型H7N9流感病毒NS1基因核苷酸序列和氨基酸序列進行比對,結(jié)果顯示2013年甲型H7N9流感病毒NS1蛋白與以往流感病毒的NS1蛋白序列有一定的同源性。甲型流感病毒NS1蛋白在氨基酸序列上發(fā)生變異,影響到流感病毒的致病性及病毒復(fù)制效率。近年來,關(guān)于NS1蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究結(jié)果顯示主要功能是結(jié)合多種宿主細胞的蛋白。在流感病毒侵染宿主細胞后合成NS1蛋白,在宿主細胞內(nèi)合成后,能定位于細胞核內(nèi),參與調(diào)控宿主細胞的多種免疫反應(yīng)(Min等,2007)。NSl蛋白在流感病毒感染的早期細胞內(nèi)可檢測到,而在成熟的病毒粒子里檢測不到。NS1蛋白是一種多功能調(diào)節(jié)蛋白:①NS1蛋白抑制宿主細胞蛋白的合成、誘導細胞
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