發(fā)布時間：2020-11-18 12:22

　　 目的：Kringle5(簡稱K5)蛋白在畢赤酵母中高效分泌表達、純化及其質量評價方法研究，以及K5蛋白哺乳動物細胞分泌表達質粒的構建。 方法：首先，用電轉化的方法將p819-8αK5質粒轉入畢赤酵母菌GS115感受態(tài)，通過不同濃度(2mg／ml、4mg／ml和8mg／ml)的G418—YPD平板結合表達量的篩選方法篩選出高效分泌表達K5蛋白的畢赤酵母菌。建立由DEAE離子交換層析和S—100分子篩層析為主體的純化工藝流程。對純化的蛋白進行質量評價試驗，包括蛋白質的一般性質測定，如分子量、純度、等電點、含量等以及生物學活性方面的測定，細胞水平：內皮細胞增殖抑制試驗、內皮細胞遷移抑制試驗；組織水平：雞胚絨毛尿囊膜血管生成抑制試驗；整體水平：移植瘤生長抑制試驗。其次，通過兩步PCR方法按照人的密碼子偏愛性合成K5蛋白的DNA序列，克隆至哺乳動物細胞表達載體pDV，并對其生物學活性進行初步研究。 結果：得到了一批具有高效分泌表達K5蛋白能力的畢赤酵母菌株，在誘導茵液上清中，K5蛋白含量在200mg／L以上。初步建立了純化工藝流程，經純化后的蛋白純度在95％以上。測定了K5蛋白的一些理化指標，表觀分子量在15％SDS—PAGE膠中表現(xiàn)為17.5KD左右；在等電聚焦電泳中其等電點表現(xiàn)為pH5.2左右。探討了K5蛋白生物學活性測定方法，細胞水平：在內皮細胞增殖抑制試驗中，K5蛋白表現(xiàn)出對內皮細胞增殖有抑制作用；在內皮細胞遷移抑制試驗中，表現(xiàn)出對內皮細胞遷移的抑制作用；組織水平：在雞胚絨毛尿囊膜血管生成抑制試驗中，表現(xiàn)出對雞胚絨毛尿囊膜上的微小血管的生成和發(fā)育干擾作用；整體水平：在H22鼠源移植瘤生長抑制試
【學位單位】：中國藥品生物制品檢定所
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2004
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

圖1.2p819一8aKS表達載體的酶切MZ:DL2000;1:hIol(1851bp+p+1241bp+1321bp+1837bp+2555bp+33bp+2458bp+7077bp);4:ECo腳(5078bp+4bp+1277bp+8961bp);6:石叮刀dlll(1851b知，各條帶與理論值一致，說明p819一8o

中國藥品生物制品檢定所碩士學位論文實驗結果載體鑒定的示意圖體p819是胞內表達載體pA08巧和分泌表達，p819一8aKS含有八個拷貝的K5蛋白分泌方I之間.

圖1.3轉化菌株的篩選:MD平板;B:Zmg/mlG418一YpD平C:4mg/mlG418一YPD平板;D:smgm/1G418一萬PD平轉化的方法，在MD平板上得到200~300多個轉化子，G418一YPD平板上仍能生長，將這7個轉化子分別命名70℃、2既甘油一YDP培養(yǎng)基中保存，并進一步在搖瓶水物t’的鑒定結果到的7個轉化子在姍平板上都能正常生長形成菌落，7個轉化子都在酵母菌基因組上的Aoxl基因處發(fā)生插篩選結果.4可以看出，Y1和Y4表達量很低，幾乎沒有K5蛋白，均在0.3mgm/1以上，純度分別為為70.4%、81.3%之，但表達量也在0.mZgm/l以上，因此我們選取Y5
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