發(fā)布時(shí)間：2020-11-18 12:22

　　 目的：Kringle5(簡(jiǎn)稱K5)蛋白在畢赤酵母中高效分泌表達(dá)、純化及其質(zhì)量評(píng)價(jià)方法研究，以及K5蛋白哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。 方法：首先，用電轉(zhuǎn)化的方法將p819-8αK5質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母菌GS115感受態(tài)，通過(guò)不同濃度(2mg／ml、4mg／ml和8mg／ml)的G418—YPD平板結(jié)合表達(dá)量的篩選方法篩選出高效分泌表達(dá)K5蛋白的畢赤酵母菌。建立由DEAE離子交換層析和S—100分子篩層析為主體的純化工藝流程。對(duì)純化的蛋白進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)試驗(yàn)，包括蛋白質(zhì)的一般性質(zhì)測(cè)定，如分子量、純度、等電點(diǎn)、含量等以及生物學(xué)活性方面的測(cè)定，細(xì)胞水平：內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)、內(nèi)皮細(xì)胞遷移抑制試驗(yàn)；組織水平：雞胚絨毛尿囊膜血管生成抑制試驗(yàn)；整體水平：移植瘤生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)。其次，通過(guò)兩步PCR方法按照人的密碼子偏愛(ài)性合成K5蛋白的DNA序列，克隆至哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pDV，并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行初步研究。 結(jié)果：得到了一批具有高效分泌表達(dá)K5蛋白能力的畢赤酵母菌株，在誘導(dǎo)茵液上清中，K5蛋白含量在200mg／L以上。初步建立了純化工藝流程，經(jīng)純化后的蛋白純度在95％以上。測(cè)定了K5蛋白的一些理化指標(biāo)，表觀分子量在15％SDS—PAGE膠中表現(xiàn)為17.5KD左右；在等電聚焦電泳中其等電點(diǎn)表現(xiàn)為pH5.2左右。探討了K5蛋白生物學(xué)活性測(cè)定方法，細(xì)胞水平：在內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)中，K5蛋白表現(xiàn)出對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖有抑制作用；在內(nèi)皮細(xì)胞遷移抑制試驗(yàn)中，表現(xiàn)出對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制作用；組織水平：在雞胚絨毛尿囊膜血管生成抑制試驗(yàn)中，表現(xiàn)出對(duì)雞胚絨毛尿囊膜上的微小血管的生成和發(fā)育干擾作用；整體水平：在H22鼠源移植瘤生長(zhǎng)抑制試
【學(xué)位單位】：中國(guó)藥品生物制品檢定所
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

圖1.2p819一8aKS表達(dá)載體的酶切MZ:DL2000;1:hIol(1851bp+p+1241bp+1321bp+1837bp+2555bp+33bp+2458bp+7077bp);4:ECo腳(5078bp+4bp+1277bp+8961bp);6:石叮刀dlll(1851b知，各條帶與理論值一致，說(shuō)明p819一8o

中國(guó)藥品生物制品檢定所碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)結(jié)果載體鑒定的示意圖體p819是胞內(nèi)表達(dá)載體pA08巧和分泌表達(dá)，p819一8aKS含有八個(gè)拷貝的K5蛋白分泌方I之間.

圖1.3轉(zhuǎn)化菌株的篩選:MD平板;B:Zmg/mlG418一YpD平C:4mg/mlG418一YPD平板;D:smgm/1G418一萬(wàn)PD平轉(zhuǎn)化的方法，在MD平板上得到200~300多個(gè)轉(zhuǎn)化子，G418一YPD平板上仍能生長(zhǎng)，將這7個(gè)轉(zhuǎn)化子分別命名70℃、2既甘油一YDP培養(yǎng)基中保存，并進(jìn)一步在搖瓶水物t’的鑒定結(jié)果到的7個(gè)轉(zhuǎn)化子在姍平板上都能正常生長(zhǎng)形成菌落，7個(gè)轉(zhuǎn)化子都在酵母菌基因組上的Aoxl基因處發(fā)生插篩選結(jié)果.4可以看出，Y1和Y4表達(dá)量很低，幾乎沒(méi)有K5蛋白，均在0.3mgm/1以上，純度分別為為70.4%、81.3%之，但表達(dá)量也在0.mZgm/l以上，因此我們選取Y5
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