發(fā)布時(shí)間：2020-11-08 15:36

　　 研究背景:指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù)系指在體外從人工合成的ssDNA或RNA 隨機(jī)序列庫(kù)中尋找與靶分子特異結(jié)合片段的過(guò)程,其實(shí)質(zhì)是試管中的人工進(jìn)化。篩選出的分子稱為核酸適體(aptamer)。隨機(jī)庫(kù)中核酸分子空間構(gòu)象的多樣性是核酸分子與其它分子相互作用的基礎(chǔ)。核酸適體代表著一類功能與抗體相似的新型分子,它的靶分子廣、分辨率高、化學(xué)修飾便利、組織穿透能力強(qiáng)等特點(diǎn),令其在基礎(chǔ)研究、臨床診斷、藥物研制方面得以廣泛應(yīng)用。目前,VEGF、癌細(xì)胞表面特定蛋白Nucleolin及凝血酶的核酸適體已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。 TGF-βs在纖維化病變的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,其受體主要分三型:TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ和TGF-βRⅢ。TGF-βRⅢ主要負(fù)責(zé)將間質(zhì)中的TGF-βs傳遞給TGF-βRⅡ并增強(qiáng)它們之間的親和性。TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ均屬跨膜的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體家族,其中TGF-βRⅡ能自由地與TGF-βs結(jié)合,而TGF-βRⅠ僅能識(shí)別配體與TGF-βRⅡ形成的復(fù)合物并被激活。激活的TGF-βRⅠ可進(jìn)一步磷酸化下游的信號(hào)分子如Smad,引起Smad向核內(nèi)轉(zhuǎn)位,從而介導(dǎo)TGF-βs的一系列生物學(xué)效應(yīng)。因此,以TGF-βRⅡ蛋白為靶點(diǎn)篩選和研制其拮抗劑,封阻TGF-βs的生物學(xué)活性,對(duì)于纖維化病變的防治具有積極意義。迄今為止,還未見(jiàn)TGF-βRⅡ核酸適體的研究報(bào)道。本研究初步探討了利用SELEX技術(shù)從ssDNA隨機(jī)庫(kù)中富集TGF-βRⅡ親和核酸庫(kù)的方法,為后續(xù)分離TGF-βRⅡ單一核酸適體,獲取TGF-βRⅡ新型拮抗劑奠定了基礎(chǔ)。 材料與方法: 1. 初始ssDNA隨機(jī)庫(kù)的構(gòu)建 設(shè)計(jì)中間含60個(gè)隨機(jī)堿基、兩端為固定序列、總長(zhǎng)108nt的ssDNA模板,交由公司合成。產(chǎn)品已做去保護(hù)及純化處理。 2. SELEX篩選 1) 首輪篩選:直接取適量合成的ssDNA做為初始篩選庫(kù)(ssDNA-0),初始庫(kù)容量 WP=10 為1.2×1015。靶蛋白TGF-βRⅡ與ssDNA-0溫育后,反應(yīng)混合液上樣到硝酸纖維素膜上,真空抽濾,洗脫游離核酸。7M尿素、酚/氯仿回收膜上滯留的ssDNA。行PCR擴(kuò)增時(shí),采用5(端生物素化的下游引物,使PCR產(chǎn)物偶聯(lián)上生物素。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物。利用Streptavidin-Agarose捕獲dsDNA,0.15N的 NaOH使雙鏈變性,釋放非生物素標(biāo)記的ssDNA,回收后用于第2輪篩選。 2) 第2～4輪篩選:將靶蛋白TGF-βRⅡ預(yù)先吸附到固相基質(zhì)Phenyl-Agarose上,然后與ssDNA富集庫(kù)溫育,洗脫未結(jié)合核酸,回收與TGF-βRⅡ結(jié)合的ssDNA。擴(kuò)增、富集、分離目的ssDNA步驟同前。從第3輪篩選始,引入針對(duì)固相基質(zhì)Phenyl-Agarose的反向篩選。 3) 第5～8輪篩選:與第3～4輪篩選相比,做兩點(diǎn)調(diào)整:(1)反向篩選調(diào)整為:富集庫(kù)與預(yù)先吸附了BSA的固相基質(zhì)Phenyl-Agarose溫育。(2)篩選時(shí),向篩選緩沖體系中加入酵母tRNA。隨著篩選的進(jìn)行,嚴(yán)謹(jǐn)度不斷增加。 3. 監(jiān)測(cè)富集庫(kù)進(jìn)化狀態(tài) 1) 膜結(jié)合測(cè)定實(shí)驗(yàn): 將 32P放射性標(biāo)記的初始庫(kù)、富集庫(kù)分別與TGF-βRⅡ及BSA溫育,反應(yīng)混合液上樣到硝酸纖維素膜上,負(fù)壓抽濾,空氣中干燥濾膜。液閃儀計(jì)數(shù)CPM值。以百分值〔(核酸蛋白組膜上放射殘留量-單純核酸組膜上放射殘留量)/投入反應(yīng)核酸的放射總量〕×100%估算核酸庫(kù)對(duì)靶蛋白的親和程度。 2) 凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn):將32P放射性標(biāo)記的初始庫(kù)、富集庫(kù)分別與TGF-βRⅡ及BSA溫育,反應(yīng)混合液上樣到4%非變性聚丙烯酰胺凝膠中,電泳,放射自顯影。 結(jié)果:第8輪富集庫(kù)對(duì)靶蛋白TGF-βRⅡ的親和力較初始隨機(jī)庫(kù)提高了22.61倍,有非常顯著的差異(P0.01)。在第8輪富集庫(kù)+TGF-βRⅡ組泳道中觀察到核酸-蛋白復(fù)合物滯后帶。同時(shí),雖然第8輪富集庫(kù)對(duì)BSA的親和力較原始庫(kù)亦提高了11.33倍,但在凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)中觀察不到BSA/ssDNA復(fù)合物滯后帶,說(shuō)明富集庫(kù)ssDNA-8與BSA的結(jié)合系非特異性的。 結(jié)論:經(jīng)過(guò)8輪循環(huán)篩選,終極富集庫(kù)對(duì)靶蛋白TGF-(RⅡ的親和力獲得了一定程度的提高,確實(shí)向著特異親和靶蛋白TGF-(RⅡ的方向進(jìn)化。本研究工作為后續(xù)分離TGF-(RⅡ單一核酸適體、獲取TGF-(RⅡ新型拮抗劑奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

圖 2. 第 1 輪 PCR 產(chǎn)物 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖1. DNA smear 現(xiàn)象2. 全長(zhǎng) dsDNA(目的片段)圖 3. 第 1 輪 PCR 產(chǎn)物 8%/變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖1. 全長(zhǎng) ssDNA(目的片段)2. 非完全擴(kuò)增片段3. 二甲苯藍(lán)染料← 1← 23 →

圖 2. 第 1 輪 PCR 產(chǎn)物 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖1. DNA smear 現(xiàn)象2. 全長(zhǎng) dsDNA(目的片段)圖 3. 第 1 輪 PCR 產(chǎn)物 8%/變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖1. 全長(zhǎng) ssDNA(目的片段)2. 非完全擴(kuò)增片段3. 二甲苯藍(lán)染料← 1← 23 →

第 1 輪 PCR 產(chǎn)物 8%非變性酰胺凝膠電泳圖NA smear 現(xiàn)象長(zhǎng) dsDNA(目的片段)圖 3. 第 1 輪 PCR 產(chǎn)物 8%/8M 尿變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖1. 全長(zhǎng) ssDNA(目的片段)2. 非完全擴(kuò)增片段3. 二甲苯藍(lán)染料← 1← 2← 1← 2
【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 陳號(hào);適體篩選過(guò)程中檢測(cè)方法的初步探索[D];西南大學(xué);2010年

2 馬文靜;適體篩選方法及分離方法的探討[D];西南大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2874978