發(fā)布時(shí)間：2018-02-26 05:04

  本文關(guān)鍵詞： 法尼酯X受體 肝細(xì)胞核因子1α 啟動(dòng)子 葡萄糖　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 法尼酯X受體(farnesoid X receptor,FXR)因其天然配體為膽汁酸,又稱為膽汁酸受體,是一種配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子,屬于核受體超家族的一員。FXR主要表達(dá)于肝臟、小腸、腎及腎上腺等組織,在心臟和脂肪組織中也有一定水平的表達(dá)。FXR可與視黃酸X受體(retinoid X receptor, RXR)以異二聚體形式結(jié)合于靶基因啟動(dòng)子的FXR反應(yīng)元件,參與多種基因表達(dá)的調(diào)控,在膽汁酸負(fù)反饋調(diào)節(jié)、糖脂代謝中發(fā)揮重要作用。目前,FXR研究的重點(diǎn)主要集中在尋找FXR新的配體、靶基因以及探討其與核受體輔活化子之間相互作用等,對(duì)FXR轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究鮮有報(bào)道。事實(shí)上,FXR自身表達(dá)水平的改變是影響脂代謝平衡的重要因素,而FXR轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制至今尚不清楚。許多參與碳水化合物代謝調(diào)節(jié)的基因都受葡萄糖或胰島素正性或負(fù)性調(diào)節(jié)。有研究表明葡萄糖也能調(diào)控FXR基因的轉(zhuǎn)錄。為研究FXR基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,探討高糖條件下FXR表達(dá)增高的機(jī)制,我們進(jìn)行了如下的研究: 1.FXR啟動(dòng)子生物信息學(xué)分析及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的確定 預(yù)測(cè)軟件(http://www.fruitfly.org/ cgi-bin/seq_tools/promoter.pl.)提示,FXR基因5′側(cè)翼區(qū)的啟動(dòng)子樣序列位于外顯子上游約1600bp范圍內(nèi)。應(yīng)用transFac professional 8.1軟件對(duì)該區(qū)域進(jìn)行搜索,獲得了多個(gè)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),其中一個(gè)重要的結(jié)合位點(diǎn)是與細(xì)胞核因子1α(hepatocyte nuclear factor 1α, HNF1α)的結(jié)合位點(diǎn)。5′端cDNA末端快速擴(kuò)增法(rapid amplification of cDNA ends, RACE)確定轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的堿基為A。該轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)位于翻譯位點(diǎn)前380bp處,比已知的FXR_mRNA(U68233、NM005123)5′端第一個(gè)堿基長(zhǎng)29 bp。 2.FXR啟動(dòng)子的活性分析 構(gòu)建包含F(xiàn)XR基因5′上游序列的熒光素報(bào)告質(zhì)粒,利用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞系,檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示啟動(dòng)子活性最小區(qū)域位于 150/+29bp,其中-150～-74bp間存在較強(qiáng)的正性調(diào)控序列。定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明-89～-84區(qū)域在FXR啟動(dòng)子中發(fā)揮重要作用。 3.體內(nèi)、體外鑒定HNF1α與FXR啟動(dòng)子活性區(qū)域的結(jié)合 染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)及電泳遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)(electrophoresis mobility shift and supershift assay, EMSA)實(shí)驗(yàn)證明:HNF1α可在體內(nèi)、外與FXR啟動(dòng)子區(qū)域相結(jié)合。 4.HNF1α調(diào)節(jié)FXR的轉(zhuǎn)錄活性 HNF1α真核表達(dá)質(zhì)粒與FXR啟動(dòng)子重組報(bào)告基因載體或與突變體的共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明,HNF1α通過與FXR啟動(dòng)子-89～-84區(qū)域結(jié)合,調(diào)控FXR啟動(dòng)子的活性。Real time PCR和免疫印跡試驗(yàn)(western blot, WB)證明:高表達(dá)HNF1α可上調(diào)HepG2細(xì)胞中FXR的表達(dá)。 5.葡萄糖對(duì)膽汁酸受體基因啟動(dòng)子的調(diào)節(jié) 在分析FXR啟動(dòng)子活性區(qū)域及鑒定相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基礎(chǔ)上,探討葡萄糖對(duì)FXR基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,高糖作用下FXR啟動(dòng)子活性增高, HepG2細(xì)胞內(nèi)HNF1α結(jié)合于FXR啟動(dòng)子的活性增高;高糖能夠上調(diào)HepG2細(xì)胞內(nèi)FXR及HNF1α的表達(dá)。結(jié)果表明高糖誘導(dǎo)的FXR表達(dá)水平增加可能與HNF1α介導(dǎo)的FXR啟動(dòng)子活性的增強(qiáng)有關(guān)。 本研究對(duì)人FXR基因5′側(cè)翼序列進(jìn)行了系列缺失分析,鑒定了啟動(dòng)子的活性區(qū)域,發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子HNF1α。在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,我們還探討了葡萄糖在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控FXR表達(dá)的機(jī)制。FXR啟動(dòng)子的鑒定及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的研究,對(duì)于我們深入認(rèn)識(shí)FXR基因自身轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及FXR在生物體內(nèi)的生理和病理作用具有重要意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R346

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1536600