發(fā)布時間：2018-02-24 03:13

  本文關(guān)鍵詞： 骨髓間充質(zhì)干細胞 趨化因子受體 脾細胞　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的 近年來對骨髓間充質(zhì)干細胞的研究初步顯示其具有促進骨髓移植后供者細胞植入的作用。動物實驗及臨床統(tǒng)計都提示了骨髓間充質(zhì)干細胞和造血干細胞的共同輸注可以提高造血干細胞的植入，但骨髓間充質(zhì)干細胞促進植入的機制尚不清楚。有關(guān)異基因造血干細胞移植后干細胞的歸巢、增殖、分化相關(guān)研究中，，其中一個研究熱點是趨化因子及其受體的相互作用。趨化因子受體是一類表達于不同類型細胞上的含有7個跨膜區(qū)的G蛋白偶聯(lián)受體超家族，通過與趨化因子作用參與細胞的生長、發(fā)育、分化、凋亡、組織分布等。它可以激活磷脂酶、脂類激酶、蛋白激酶，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子濃度，激活JAK／STAT途徑，引發(fā)一系列的信號傳導(dǎo)通路�，F(xiàn)有的研究已經(jīng)顯示趨化因子及其受體對造血干細胞的游走和歸巢有著重要作用：淋巴細胞在歸巢的過程中通過細胞膜表面的CD62L粘附于高內(nèi)皮微靜脈(HEV)，隨后淋巴細胞表面的CCR7與內(nèi)皮細胞表達的刺激淋巴組織趨化因子(SLC)相結(jié)合，CCR7-SLC的相互作用促進了T細胞歸巢到淋巴結(jié)；在B細胞方面，BLC／CXCR5可以引導(dǎo)成熟B淋巴細胞游走和歸巢，并對成熟B細胞在次級淋巴細胞中的B細胞區(qū)的發(fā)育有著重要作用。趨化因子及其受體除了可以促進造血細胞歸巢，它們對造血細胞的增殖和分化也有重要作用：SDF-1／CXCR4參與了造血細胞的增殖、分化、遷移等活動，且早期B淋巴干細胞發(fā)育也需要CXCR4的表達；SDF-1、ELC、SLC、TECK、MDC等趨化因子在T細胞胸腺中分化的不同階段發(fā)揮著不同的趨化作用，且SLC和ELC共同肩負著T細胞在二級淋巴器官內(nèi)的分布。他們也在DC與T細胞的相互作用、T細胞的激活、極化、效應(yīng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用�；�于趨化因子及其受體對造血細胞歸巢及增殖分化方面的作用，為了解骨髓間充質(zhì)干細胞促進造血干細胞植入的相關(guān)機制，我們研究了骨髓間充質(zhì)干細胞對T細胞表面趨化因子受體表達的影響，進一步探索MSC的免疫調(diào)控機制。 方法 1、骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)和生物學(xué)特性研究：無菌條件下采集健康志愿者骨髓液及C57BL／6小鼠股、脛骨骨髓，分別以2.0×10~5的密度接種培養(yǎng)，24～48小時后棄去懸浮細胞，以后每3天換1次液。待細胞生長到80～90％融合時，按1：4～5的比例傳代培養(yǎng)。分別取第1代，第3代和第5代繪制生長曲線。第4～5代各取2×10~5個細胞，采用雙色標(biāo)記法標(biāo)記CD34、CD44、CD166、HLA-DR單抗。經(jīng)流式細胞儀分析陽性細胞的百分率。 2、骨髓間充質(zhì)干細胞對PHA誘導(dǎo)小鼠脾細胞增殖后趨化因子受體表達的影響：C57BL／6小鼠脾細胞以1×10~6／孔的密度接種于24孔板，加入植物血凝素，培養(yǎng)72小時。實驗分三組：A組按10％比例加入MSC；B組按1％比例加入MSC；對照組不加MSC。3天后收集懸浮的脾細胞進行流式細胞術(shù)檢測。 3、小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞與骨髓細胞聯(lián)合輸入動物模型的建立：無菌條件下取C57BL／6小鼠骨髓，骨髓移植第0天BALB／c小鼠經(jīng)~(60)Co全身照射(TBI9.0Gy，0.5Gy／min)，4小時內(nèi)接受骨髓移植。實驗分三組：A組BMC4×10~7及MSC 4×10~5；B組BMC4×10~7及生理鹽水；C組生理鹽水。觀察指標(biāo)：1、小鼠的生存時間及一般情況；2、小鼠的體重變化。 4、數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析：數(shù)據(jù)以用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)或百分率(％)表示。采用SPSS 12.0 for Windows軟件進行單因素方差分析，多組間進行LSD-test。 結(jié)果： 1、臨床獲取的健康人骨髓液經(jīng)淋巴細胞分離液分離后，可獲得乳白色的細胞層。該層細胞及C57BL／6小鼠骨髓單細胞懸液各自接種培養(yǎng)24～48小時后，棄去未貼壁細胞，可見貼壁生長的骨髓間充質(zhì)干細胞散在分布，形態(tài)均呈梭形、扁平形和小圓形，約3～4天后貼壁細胞迅速增殖，6天后開始出現(xiàn)較大的克隆，10天左右細胞生長達到80％以上融合。細胞漸趨向均一的長梭形，漩渦狀分布。待細胞生長到80～90％融合時傳代培養(yǎng)，約7～10天傳代一次，傳代后細胞生長較原代細胞快，約7天左右細胞再次融合達80～90％。細胞形態(tài)逐漸趨向為螺旋狀排列的長梭形細胞，類似成纖維細胞形態(tài)。連續(xù)傳代約10代后細胞開始出現(xiàn)凋亡，塊狀死亡脫落后并片狀蔓延。C57BL／6小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)上較健康人骨髓間充質(zhì)干細胞小，細胞界限更清晰。從對P1、P2、P3代細胞的生長曲線進行觀察，發(fā)現(xiàn)三代細胞具有以下共同特征：傳代培養(yǎng)的潛伏期為24～36小時，對數(shù)增殖期約為2～3天，對數(shù)增殖期后第5天進入平臺期。小鼠及健康人來源的骨髓間充質(zhì)干細胞生長增殖規(guī)律大致相似。流式細胞儀檢測生長良好的第3代hMSC顯示CD44、CD166表達陽性，CD34、HLA-DR表達為陰性。 2、脾細胞經(jīng)PHA刺激及與MSC共培養(yǎng)后趨化因子受體表達變化：脾細胞經(jīng)PHA刺激后均可檢測到CCR5、CCR7及CXCR3三種趨化因子受體的表達，在MSC共培養(yǎng)體系中，趨化因子受體表達受MSC的影響且表達水平的變化與MSC濃度有關(guān)(表1)。實驗結(jié)果表明，骨髓間充質(zhì)干細胞在與CD3脾細胞呈一定的細胞比例共培養(yǎng)時能上調(diào)T細胞趨化因子受體CCR5、CCR7、CXCR3的表達，對前二者，在實驗范圍內(nèi)隨著MSC濃度的增高，趨化因子受體的表達越高。 3、脾細胞經(jīng)PHA刺激及與MSC共培養(yǎng)后各細胞亞群趨化因子受體表達變化：CXCR3陽性細胞中僅CD3~+CD8~+細胞群可以觀察到趨化因子受體隨著MSC濃度增高而表達增高，CD3~+CD8~-細胞群在各濃度趨化因子受體表達無顯著差異；CCR5陽性細胞主要在CD3~+CD8~-細胞群中可以觀察到趨化因子受體的表達隨著MSC濃度增高而增強，CD3~+CD8~+細胞群僅在MSC濃度為10％時較無MSC時表達增高；CCR7陽性細胞則在CD3~+CD8~-和CD3~+CD8~+細胞均可觀察到趨化因子受體的表達隨著MSC濃度增高而增強。 4、+5天C組小鼠死亡66.7％，其余小鼠生存均超過30天。各組小鼠均出現(xiàn)毛發(fā)稀少、發(fā)抖等情況。考慮為照射后出現(xiàn)的非特異性表現(xiàn)。體重變化圖提示A組小鼠體重緩慢上升，B組小鼠體重上升后有所下降，C組小鼠體重緩慢下降。 結(jié)論 1、骨髓間充質(zhì)干細胞生長規(guī)律與文獻報道相似，對本試驗室條件下細胞生長周期及生長條件的掌握對下一步實驗打下基礎(chǔ)。 2、流式細胞儀檢測生長良好的第3代健康人MSC顯示CD44、CD166表達陽性，CD34、HLA-DR表達為陰性。符合相關(guān)文獻報道。 3、骨髓間充質(zhì)干細胞在與脾細胞呈一定的細胞比例共培養(yǎng)時能上調(diào)T細胞趨化因子受體CCR5、CCR7、CXCR3的表達，對前二者隨著MSC細胞濃度提高，趨化因子受體表達更強。上述三種趨化因子受體在CD3~+CD8~-和CD3~+CD8~+兩大亞群中表達上調(diào)的分布不同。研究結(jié)果顯示，骨髓間充質(zhì)干細胞在一定濃度范圍內(nèi)能提高T細胞趨化因子受體表達，這可能有利于骨髓移植后促使淋巴細胞在趨化因子的作用下移行和歸巢到骨髓及淋巴器官，從而有利于促進造血細胞植入。這可能是骨髓間充質(zhì)干細胞促進異基因造血干細胞植入的機制之一。 4、骨髓細胞與間充質(zhì)干細胞混合輸注的動物模型基本確立骨髓細胞輸注的數(shù)量級，間充質(zhì)干細胞輸注后并未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)；經(jīng)過照射的BALB／c小鼠可以出現(xiàn)非特異性照射病，表現(xiàn)為毛發(fā)聳起，發(fā)抖等；該動物模型為進一步行骨髓細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞共同輸注的后續(xù)實驗打下基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R329

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 從玉文,毛秉智,羅慶良,董波,陳惠鵬;重組人粒細胞集落刺激因子治療急性放射病的實驗研究[J];實驗血液學(xué)雜志;1996年02期

2 許紅波,李春富,吳建春,楊明,馮曉勤;異種骨髓移植移植物抗宿主反應(yīng)的實驗動物模型[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2003年02期

本文編號：1528660