血小板參與了冠狀動(dòng)脈粥樣硬化等心血管事件的病理進(jìn)程。在治療中，雖然抗血小板治療效果肯定，但是仍有部分患者發(fā)生心肌梗死、猝死等不良事件。因此對(duì)于血小板生理病理深入研究就顯得十分必要。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究采用斑馬魚(yú)作為平臺(tái)，與其他模式生物相比，斑馬魚(yú)具有高繁殖力、體外受精、胚胎透明及養(yǎng)殖造價(jià)低等特點(diǎn)，其在心血管領(lǐng)域尤其是血小板研究中的應(yīng)用越來(lái)越受到重視。

　　1 斑馬魚(yú)的特點(diǎn)斑馬魚(yú)(Danio rerio)是屬于輻鰭亞綱鯉科短擔(dān)尼魚(yú)屬的一種硬骨魚(yú)。Streisinger等首先對(duì)斑馬魚(yú)成功實(shí)施了體外受精技術(shù)、單倍體誘導(dǎo)技術(shù)，建立了純合品系，并獲得了第一個(gè)自然突變體——golden。此后斑馬魚(yú)就開(kāi)始作為模式生物應(yīng)用于生命科學(xué)研究中。斑馬魚(yú)具有以下特點(diǎn)：(1)成年魚(yú)個(gè)體小，易于飼養(yǎng)。(2)發(fā)育快速、性成熟期短、繁殖力強(qiáng)。(3)胚胎體外發(fā)育，易于觀察和操作。(4)較完善的胚胎和遺傳學(xué)操作技術(shù)。(5)基因組序列的注釋即將完成。(6)品系資源豐富。

　　2 斑馬魚(yú)血小板的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)與人類(lèi)血小板不同，筆耕論文，斑馬魚(yú)血小板為帶有稀疏細(xì)胞質(zhì)巨大細(xì)胞核的有核細(xì)胞。在光鏡下斑馬魚(yú)的血小板與淋巴細(xì)胞的形態(tài)相似，但血小板胞質(zhì)更加致密，通過(guò)血小板聚集實(shí)驗(yàn)可以鑒別淋巴細(xì)胞和血小板。電鏡下斑馬魚(yú)血小板細(xì)胞表面光滑，染色質(zhì)致密，細(xì)胞質(zhì)中包含大量的囊泡，有些通過(guò)小管系統(tǒng)開(kāi)口于細(xì)胞膜。此外還可觀察到偽足樣突起。

　　3 斑馬魚(yú)血小板與人類(lèi)血小板的相似性盡管斑馬魚(yú)血小板與人類(lèi)血小板在形態(tài)上具有一定差異，但二者在生理功能方面具有相似性，例如血小板的黏附、激活聚集、釋放反應(yīng)等 ]。因此，利用斑馬魚(yú)作為模式生物研究血小板的生理病理功能，具有較強(qiáng)的可行性和應(yīng)用前景。

　　3．1 血小板黏附血管內(nèi)膜在一系列外來(lái)刺激條件下發(fā)生損傷，血小板通過(guò)特定的膜受體結(jié)合到內(nèi)皮下細(xì)胞外基質(zhì)上，從而觸發(fā)血栓的形成，促進(jìn)止血和血管的修復(fù)。在人類(lèi)，血小板膜表面的黏附蛋白糖蛋白工b—V—IX(GP工b—V—IX)通過(guò)血管性血友病因子(vWF)與內(nèi)皮下細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合。vwF由血管內(nèi)皮細(xì)胞及巨核細(xì)胞合成和分泌，是一種存在于血漿、內(nèi)皮細(xì)胞表面和血小板a顆粒的糖蛋白。vwF可與膠原及血小板膜GP工b和GPⅡb／IIIa結(jié)合，在血小板黏附與聚集中發(fā)揮重要作用。血小板也可以通過(guò)GP1I b／11a與vWF結(jié)合從而黏附到細(xì)胞外基質(zhì)，但這過(guò)程僅在血小板活化變形后發(fā)生，使黏附更加牢固。有關(guān)研究在斑馬魚(yú)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了vwF mRNA 和vwF的存在。斑馬魚(yú)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)血小板表面黏附蛋白的種類(lèi)與人類(lèi)血小板保持一致，兩者結(jié)構(gòu)相似性很高。

　　3．2 血小板的激活及聚集血小板與內(nèi)皮下細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合后導(dǎo)致血小板激活，繼而釋放活性物質(zhì)如花生四烯酸及血栓素A2(TXA2)等，加速活化進(jìn)程。TXA2是花生四烯酸代謝過(guò)程中生成的具有很強(qiáng)生理活性的產(chǎn)物，具有強(qiáng)烈的血小板聚集作用，能促使血小板聚集形成血栓。血小板活化后，蘊(yùn)含其中的致密顆粒釋放活性物質(zhì)，如二磷酸腺苷、凝血酶等，它們激活并招募循環(huán)血中的靜息血小板，富集于損傷部位，這過(guò)程為血小板聚集，此反應(yīng)的發(fā)生與血小板之間的GPⅡb／Ⅲa黏附密切相關(guān)。斑馬魚(yú)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索顯示，在斑馬魚(yú)血小板上存在二磷酸腺苷受體。凝血酶活化血小板主要通過(guò)一族G蛋白偶連的蛋白酶活化受體(PARs)介導(dǎo)。人類(lèi)凝血酶受體為PAR1—4，在斑馬魚(yú)上經(jīng)證實(shí)也存在PAR1—4。有文獻(xiàn)報(bào)道了27種斑馬魚(yú)PAR，例如PAR1家族、PAR2家族等。環(huán)氧酶(COX)是花生四烯酸代謝過(guò)程中前列腺素(PGs)合成的限速酶，具有2種結(jié)構(gòu)亞型，即結(jié)構(gòu)型COX一1和誘導(dǎo)型COX一2。斑馬魚(yú)擁有COX一1和C0X一2兩種酶，而哺乳動(dòng)物僅擁有COX一1一種酶l1。此外，磷脂酶A2及血栓素A合成酶一1也被發(fā)現(xiàn)存在于斑馬魚(yú)體內(nèi)。斑馬魚(yú)血小板同樣可以被膠原、二磷酸腺苷、瑞托霉素、花生四烯酸等激活而發(fā)生聚集�？傊�，斑馬魚(yú)血小板與人類(lèi)血小板激活受體及花生四烯酸代謝相關(guān)酶具有高度相似性。Jagadeeswaran等 利用瑞斯托霉素、膠原、凝血酶、二磷酸腺苷和花生四烯酸刺激斑馬魚(yú)全血發(fā)現(xiàn)血液凝固，表明了人類(lèi)與斑馬魚(yú)血小板在激活和聚集方面具有一定的相似性。

　　3．3 血小板的分泌血小板細(xì)胞內(nèi)含有豐富的胞內(nèi)顆粒，包括致密體、a顆粒、溶酶體。致密體中含有ATP、ADP、Ca 、5-羥色胺、磷酸和胍核苷酸。其中，a顆粒含有許多酶及酶的抑制劑，以及部分粘附分子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子樣蛋白和凝血因子等 。在正常血循環(huán)中血小板處于靜息狀態(tài)，在受到生理或物理刺激因子作用時(shí)，血小板發(fā)生活化伸出偽足并釋放胞內(nèi)顆粒內(nèi)容物，參與生理性止血或病理性血栓形成等。同樣，斑馬魚(yú)在血小板分泌的特性和分泌的物質(zhì)方面與人類(lèi)相比也基本相同。

　　4 利用斑馬魚(yú)作為模式生物研究血小板由于斑馬魚(yú)和人類(lèi)血小板的相似性，使得在斑馬魚(yú)體內(nèi)研究血小板功能，為探索人類(lèi)血小板相關(guān)疾病的病理機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。但是由于斑馬魚(yú)血小板功能研究起步較晚，目前還處于初級(jí)階段，相關(guān)報(bào)道還較少。CD41抗原是一種相對(duì)分子質(zhì)量為14 000的糖蛋白，CD41分子是整合素a1Ib鏈，也稱(chēng)血小板表面GPⅡb，是位于血小板表面的黏附蛋白受體，有文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)顯微注射CD41一GFP質(zhì)粒構(gòu)建CD41一GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，用綠色熒光蛋白標(biāo)記斑馬魚(yú)血小板，受精后48 h在斑馬魚(yú)幼魚(yú)動(dòng)靜脈中出現(xiàn)帶有綠色熒光的血小板，這樣就可以在熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下直接觀察血小板l1 。Gregory等 發(fā)展了激光介導(dǎo)血栓形成的方法來(lái)評(píng)估血小板的止血及凝血功能。這種方法主要是通過(guò)將斑馬魚(yú)幼魚(yú)暴露在FeC1 ，或者利用激光損傷的方法損傷血管壁，構(gòu)建血管閉塞模型，并檢測(cè)以下4個(gè)指標(biāo)：從激光損傷到動(dòng)脈閉塞的時(shí)間、從激光損傷到第一個(gè)血小板附著的時(shí)間、從激光損傷到血栓完全溶解所需的時(shí)間、形成血栓的表面積，從而通過(guò)衡量這些指標(biāo)來(lái)了解血小板功能的變化 ]。上述CD41一GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)及斑馬魚(yú)血管損傷模型的建立為后續(xù)血小板的研究提供了良好的平臺(tái)。此外，基因敲除技術(shù)在斑馬魚(yú)研究中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，同樣在斑馬魚(yú)血小板功能研究方面也應(yīng)用廣泛。斑馬魚(yú)基因敲除技術(shù)主要是通過(guò)將相關(guān)基因的嗎啉基寡核苷酸顯微注射至斑馬魚(yú)胚胎內(nèi)，從而達(dá)到目的基因敲除的目的�；�因敲除技術(shù)應(yīng)用于斑馬魚(yú)使得大規(guī)模篩選血小板功能調(diào)控基因成為可能。Williams等 。 利用斑馬魚(yú)血管損傷模型及基因敲除技術(shù)篩選出prkca、prkcb在維持斑馬魚(yú)血小板功能方面發(fā)揮重要作用，敲除這些基因后斑馬魚(yú)出現(xiàn)出血及血栓表面積減低的表現(xiàn)。Mlckla為肌球蛋白輕鏈激酶的亞型，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)斑馬魚(yú)卵顯微注射mlckla的嗎啉基寡核苷酸敲除該基因，利用CD41一GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)及斑馬魚(yú)血管損傷模型評(píng)估血小板功能的改變，證明mlckla有助于血小板形狀的變化和血栓形成 。0 Connor等 通過(guò)生物信息學(xué)篩選出BA』 B 、LRRC32、DCBLD2、E5AM 、AN TXR2幾種基因可能編碼血小板膜蛋白，利用基因敲除技術(shù)實(shí)現(xiàn)上述基因的沉默，隨后在CD41一GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)上利用激光介導(dǎo)的血管損傷模型評(píng)估血小板功能的改變，證實(shí)了BAMBI、LRRC32的促進(jìn)血栓形成作用及DCBLD2、ESAM 的抑制血栓形成作用。通過(guò)注射凝血酶基因的嗎啉基寡核苷酸實(shí)現(xiàn)凝血酶基因的敲除，然后分析相關(guān)基因表達(dá)的改變，發(fā)現(xiàn)一種phlda3的基因表達(dá)明顯升高 。向成年斑馬魚(yú)靜脈內(nèi)注射a1I6的嗎啉基寡核苷酸敲除該基因，證實(shí)a1Ib基因在維持血小板的正常止血功能上具有重要作用，同時(shí)發(fā)展了一種在成年斑馬魚(yú)體內(nèi)敲除基因的方法。

　　5 展望由于斑馬魚(yú)與人類(lèi)血小板的高度相似性，未來(lái)利用斑馬魚(yú)作為平臺(tái)，結(jié)合基因誘變、基因敲除、轉(zhuǎn)基因和胚胎學(xué)技術(shù)，廣泛開(kāi)展血小板功能的研究成為可能。利用CD41一GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)以及激光介導(dǎo)的血管損傷技術(shù)，可以大量篩選影響血小板功能的基因。同時(shí)，斑馬魚(yú)的高繁殖力、幼魚(yú)早期透明等優(yōu)點(diǎn)也將為相關(guān)研究的開(kāi)展提供便利。隨著斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)技術(shù)越來(lái)越成熟，其在血小板研究中的優(yōu)勢(shì)將會(huì)更加突出。