發(fā)布時間：2020-11-13 20:38

　　 為研究環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶入核的機(jī)制,利用兔外周血B細(xì)胞篩選抗人cGAS蛋白單克隆抗體.針對已三次免疫人cGAS(161-522)蛋白的新西蘭兔,運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)得到陽性效應(yīng)B細(xì)胞,在單管里對單細(xì)胞裂解,得到總RNA,逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA,兩步巢式PCR擴(kuò)增同一個B細(xì)胞來源的抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)序列,抗體基因擴(kuò)增成功率高達(dá)80%以上.293T重組表達(dá)兔抗人cGAS蛋白單克隆抗體并鑒定,獲得1個具有較好結(jié)合特異性的兔抗人cGAS蛋白單克隆抗體,ELISA檢測結(jié)果顯示抗體的效價達(dá)1∶10 000.
【部分圖文】：

??甲芟赴???30.6%;最后在第四個象限圈出P5，P5是P4門的子門，即CD4-/CD8-/Tlymphosite-/IgM-/IgG+/anti-cGAS+B細(xì)胞，P5中有127個細(xì)胞，占總細(xì)胞數(shù)的0.9%．通過分析之后的結(jié)果進(jìn)行分選，最終將P5的細(xì)胞從流式細(xì)胞儀中分選出來，約占所有PBMC的1.3%．2.2兔抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)序列的獲得將單個B細(xì)胞進(jìn)行ＲNA提取，cDNA反轉(zhuǎn)錄后，用設(shè)計和整理的一套巢式擴(kuò)增引物對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示經(jīng)過兩輪PCＲ后，均能獲得目的大小的條圖2流式分選術(shù)分選CD4-/CD8-/Tlymphosite-/IgM-/IgG+/anti-cGAS+B細(xì)胞Fig.2CellsortingofCD4-/CD8-/Tlymphosite-/IgM-/IgG+/anti-cGAS+BcellsbyFACS帶，結(jié)果見圖3．將其割膠回收，重鏈可變區(qū)克隆于PFUSEss-CHIg-rG-03，輕鏈可變區(qū)克隆于PFUSE2ss-CLIg-rk1質(zhì)粒，通過Sanger測序，驗(yàn)證抗體序列的重鏈和輕鏈信息．得到24個B細(xì)胞的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列信息，以克隆23測序數(shù)據(jù)為例，其使用IMGT數(shù)據(jù)庫(http:∥www.imgt.org/)可以比對到一個抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)序列信息，其中重鏈氨基酸序列比對信息顯示:V區(qū)使用的是胚系IGHV1S7*01基因，D區(qū)基因使用的是IGHD2-1*01;J區(qū)基因使用的是胚系IGHJ4*01基因，結(jié)果見表1;而輕鏈基因比對信息顯示:V區(qū)基因使用的是胚系IGKV1S37*01基因，J區(qū)使用的是胚系IGKJ1-2*01基因，結(jié)果見表2．圖3單個B細(xì)胞使用重輕鏈引物擴(kuò)增的第二輪PCＲ結(jié)果Fig.3SecondＲoundPCＲproductsofVH，V-KAPPAdomaingenesfromsingleBcell表1克隆23中兔Ig重鏈可變區(qū)胚系基因Tab.1Ｒabbitgerm

第6期傅雅娟，等:從單個兔B細(xì)胞獲得抗人cGAS蛋白單克隆抗體2.3抗人cGAS抗體的表達(dá)及鑒定將重組重鏈表達(dá)載體和輕鏈表達(dá)載體匹配，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞表達(dá)抗體，收取細(xì)胞上清檢測抗體效價，結(jié)果見圖4．結(jié)果顯示24個抗體中，克隆19，20，21，22，23能特異性和人cGAS(161－522)蛋白結(jié)合．為進(jìn)一步確定抗體效價，將抗體克隆23進(jìn)行梯度稀釋，結(jié)果見圖5，ELISA結(jié)果檢測發(fā)現(xiàn)抗體克隆23滴度達(dá)到在1∶10000，具有良好的活性．圖4ELISA測定細(xì)胞上清表達(dá)抗體效價Fig.4MeasurementofantibodyserumtiterofcellculturemediumbyELISA圖5ELISA檢測B細(xì)胞克隆23的抗體效價Fig.5MeasurementantibodytiterofBcellclone23byELISA3討論從兔外周血B細(xì)胞中篩選兔單克隆抗體的技術(shù)，較傳統(tǒng)雜交瘤方法具有明顯的優(yōu)勢．使用單B細(xì)胞技術(shù)擴(kuò)增單克隆抗體，可省略B細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的時間，更快速地獲得有效的抗體;同時也極大的節(jié)約成本．該方法不依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞，因此它不僅可應(yīng)用于兔外周血B細(xì)胞，還可以應(yīng)用于多個物種，包括小鼠、人類等［25］．單個B細(xì)胞抗體技術(shù)制備技術(shù)已經(jīng)成為制備抗體的熱門方法．隨著B細(xì)胞的分選技術(shù)、PCＲ擴(kuò)增方法以及抗體特異性、親和力鑒定方法的成熟和完善，未來單個B細(xì)胞抗體制備技術(shù)將在診斷、臨床應(yīng)用中發(fā)揮重大的作用．環(huán)狀GMP-AMP合成酶(cyclicGMP-AMPsynthase，cGAS)是細(xì)胞內(nèi)重要的DNA感受器，可激活下游的炎癥通路．最近研究表明，用依托泊苷(etoposide)、喜樹堿(camptothecin)和過氧化氫(H2O2)三種藥物處理三種人成纖維細(xì)胞?

cGAS抗體的表達(dá)及鑒定將重組重鏈表達(dá)載體和輕鏈表達(dá)載體匹配，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞表達(dá)抗體，收取細(xì)胞上清檢測抗體效價，結(jié)果見圖4．結(jié)果顯示24個抗體中，克隆19，20，21，22，23能特異性和人cGAS(161－522)蛋白結(jié)合．為進(jìn)一步確定抗體效價，將抗體克隆23進(jìn)行梯度稀釋，結(jié)果見圖5，ELISA結(jié)果檢測發(fā)現(xiàn)抗體克隆23滴度達(dá)到在1∶10000，具有良好的活性．圖4ELISA測定細(xì)胞上清表達(dá)抗體效價Fig.4MeasurementofantibodyserumtiterofcellculturemediumbyELISA圖5ELISA檢測B細(xì)胞克隆23的抗體效價Fig.5MeasurementantibodytiterofBcellclone23byELISA3討論從兔外周血B細(xì)胞中篩選兔單克隆抗體的技術(shù)，較傳統(tǒng)雜交瘤方法具有明顯的優(yōu)勢．使用單B細(xì)胞技術(shù)擴(kuò)增單克隆抗體，可省略B細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的時間，更快速地獲得有效的抗體;同時也極大的節(jié)約成本．該方法不依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞，因此它不僅可應(yīng)用于兔外周血B細(xì)胞，還可以應(yīng)用于多個物種，包括小鼠、人類等［25］．單個B細(xì)胞抗體技術(shù)制備技術(shù)已經(jīng)成為制備抗體的熱門方法．隨著B細(xì)胞的分選技術(shù)、PCＲ擴(kuò)增方法以及抗體特異性、親和力鑒定方法的成熟和完善，未來單個B細(xì)胞抗體制備技術(shù)將在診斷、臨床應(yīng)用中發(fā)揮重大的作用．環(huán)狀GMP-AMP合成酶(cyclicGMP-AMPsynthase，cGAS)是細(xì)胞內(nèi)重要的DNA感受器，可激活下游的炎癥通路．最近研究表明，用依托泊苷(etoposide)、喜樹堿(camptothecin)和過氧化氫(H2O2)三種藥物處理三種人成纖維細(xì)胞，均發(fā)現(xiàn)DNA損傷可使cGAS核轉(zhuǎn)位增加．Co-IP實(shí)驗(yàn)提示cGAS的核轉(zhuǎn)位可能
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳歷勝;預(yù)防和治療呼吸道合胞病毒感染的單克隆抗體[J];國外醫(yī)藥.合成藥.生化藥.制劑分冊;1997年06期

2 高倩;江洪;葉茂;郭文娟;;全球單克隆抗體藥物研發(fā)現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J];中國生物工程雜志;2019年03期

3 杜鈺瀟;;單克隆抗體的發(fā)展與應(yīng)用[J];中國新通信;2019年08期

4 李忠元;;治療性單克隆抗體藥物與臨床檢驗(yàn)[J];海峽藥學(xué);2017年09期

5 李忠元;;治療性單克隆抗體藥物與臨床檢驗(yàn)[J];海峽藥學(xué);2017年10期

6 李婷婷;崔慧斐;;兔單克隆抗體的發(fā)展及應(yīng)用前景[J];食品與藥品;2012年09期

7 羅萍,鄒全明,王曉勤,馬穎;抗重組人表皮生長因子單克隆抗體的制備及生物學(xué)特性鑒定[J];微生物學(xué)雜志;2004年05期

8 段薇,張健,鄭劍玲,蘇丹,王美慧;抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體的研制[J];微生物學(xué)雜志;2004年05期

9 李鳳英,陳名道,顧衛(wèi)瓊,陳春榮,唐金鳳;人瘦素單克隆抗體的鑒定[J];放射免疫學(xué)雜志;2000年02期

10 ;一種制備單克隆抗體的更有效而經(jīng)濟(jì)的方法[J];國外醫(yī)學(xué)(臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊);1998年05期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 張亦婷;EGFRvⅢ靶向單克隆抗體CH12致食蟹猴特異性血小板減少的分子機(jī)制研究[D];中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院上海藥物研究所);2019年

2 沈永才;人蛋白C的研制及其相關(guān)研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2004年

3 樊一筍;兩株功能阻斷型CD154單克隆抗體的生物學(xué)特性及其應(yīng)用研究[D];蘇州大學(xué);2004年

4 趙麗;抗牛PrP多肽單克隆抗體的制備及其在牛PrP檢測中的應(yīng)用[D];山東大學(xué);2004年

5 溫新宇;人CD38分子的克隆表達(dá)、單克隆抗體的制備及其功能的初步研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

6 王玉剛;基于計算機(jī)輔助分子設(shè)計的抗CD20單克隆抗體的改造[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2005年

7 余自強(qiáng);抗血小板膠原受體糖蛋白VI單克隆抗體的制備和功能研究[D];蘇州大學(xué);2005年

8 游曉華;腦鈉肽單克隆抗體的制備及初步臨床應(yīng)用研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2006年

9 張小萍;SARS病毒S蛋白特異性單克隆抗體制備和抗原識別位點(diǎn)鑒定[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2005年

10 秦迎松;人促血液血管細(xì)胞生成素（Haemangiopoietin, HAPO）單克隆抗體的制備、鑒定及應(yīng)用[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2004年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 饒繼紅;CA16 VP1單克隆抗體的制備及其抗原表位分析[D];長春理工大學(xué);2019年

2 趙亭亭;Zika病毒NS1抗原的原核表達(dá)和單克隆抗體的制備[D];湖南師范大學(xué);2019年

3 孫志杰;抗人CTLA-4抗體的制備及功能研究[D];遼寧大學(xué);2019年

4 何賽;人HCMV重要抗原表位單克隆抗體的制備[D];湖南師范大學(xué);2016年

5 張彩;人乳頭瘤病毒（HPV）16型單克隆抗體的性質(zhì)鑒定及其在疫苗質(zhì)量分析中的應(yīng)用[D];廈門大學(xué);2018年

6 熊應(yīng)玲;HLA-B*5801單克隆抗體的制備及特異性檢測[D];廈門大學(xué);2018年

7 孫國蘋;泰妙菌素單克隆抗體的制備與鑒定[D];鄭州大學(xué);2019年

8 邵小慧;利用轉(zhuǎn)基因小鼠制備全人源PCSK9單克隆抗體[D];上海交通大學(xué);2017年

9 董雪;重組人VEGF單克隆抗體的制備與活性鑒定[D];長春工業(yè)大學(xué);2019年

10 張丹萍;抗嗜鉻粒蛋白A單克隆抗體的制備及其在免疫組化中的應(yīng)用[D];福建農(nóng)林大學(xué);2018年

本文編號：2882619