發(fā)布時(shí)間：2020-11-13 20:38

　　 為研究環(huán)鳥(niǎo)苷酸-腺苷酸合成酶入核的機(jī)制,利用兔外周血B細(xì)胞篩選抗人cGAS蛋白單克隆抗體.針對(duì)已三次免疫人cGAS(161-522)蛋白的新西蘭兔,運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)得到陽(yáng)性效應(yīng)B細(xì)胞,在單管里對(duì)單細(xì)胞裂解,得到總RNA,逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA,兩步巢式PCR擴(kuò)增同一個(gè)B細(xì)胞來(lái)源的抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)序列,抗體基因擴(kuò)增成功率高達(dá)80%以上.293T重組表達(dá)兔抗人cGAS蛋白單克隆抗體并鑒定,獲得1個(gè)具有較好結(jié)合特異性的兔抗人cGAS蛋白單克隆抗體,ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示抗體的效價(jià)達(dá)1∶10 000.
【部分圖文】：

??甲芟赴???30.6%;最后在第四個(gè)象限圈出P5，P5是P4門(mén)的子門(mén)，即CD4-/CD8-/Tlymphosite-/IgM-/IgG+/anti-cGAS+B細(xì)胞，P5中有127個(gè)細(xì)胞，占總細(xì)胞數(shù)的0.9%．通過(guò)分析之后的結(jié)果進(jìn)行分選，最終將P5的細(xì)胞從流式細(xì)胞儀中分選出來(lái)，約占所有PBMC的1.3%．2.2兔抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)序列的獲得將單個(gè)B細(xì)胞進(jìn)行ＲNA提取，cDNA反轉(zhuǎn)錄后，用設(shè)計(jì)和整理的一套巢式擴(kuò)增引物對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)兩輪PCＲ后，均能獲得目的大小的條圖2流式分選術(shù)分選CD4-/CD8-/Tlymphosite-/IgM-/IgG+/anti-cGAS+B細(xì)胞Fig.2CellsortingofCD4-/CD8-/Tlymphosite-/IgM-/IgG+/anti-cGAS+BcellsbyFACS帶，結(jié)果見(jiàn)圖3．將其割膠回收，重鏈可變區(qū)克隆于PFUSEss-CHIg-rG-03，輕鏈可變區(qū)克隆于PFUSE2ss-CLIg-rk1質(zhì)粒，通過(guò)Sanger測(cè)序，驗(yàn)證抗體序列的重鏈和輕鏈信息．得到24個(gè)B細(xì)胞的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列信息，以克隆23測(cè)序數(shù)據(jù)為例，其使用IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.imgt.org/)可以比對(duì)到一個(gè)抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)序列信息，其中重鏈氨基酸序列比對(duì)信息顯示:V區(qū)使用的是胚系IGHV1S7*01基因，D區(qū)基因使用的是IGHD2-1*01;J區(qū)基因使用的是胚系IGHJ4*01基因，結(jié)果見(jiàn)表1;而輕鏈基因比對(duì)信息顯示:V區(qū)基因使用的是胚系IGKV1S37*01基因，J區(qū)使用的是胚系IGKJ1-2*01基因，結(jié)果見(jiàn)表2．圖3單個(gè)B細(xì)胞使用重輕鏈引物擴(kuò)增的第二輪PCＲ結(jié)果Fig.3SecondＲoundPCＲproductsofVH，V-KAPPAdomaingenesfromsingleBcell表1克隆23中兔Ig重鏈可變區(qū)胚系基因Tab.1Ｒabbitgerm

第6期傅雅娟，等:從單個(gè)兔B細(xì)胞獲得抗人cGAS蛋白單克隆抗體2.3抗人cGAS抗體的表達(dá)及鑒定將重組重鏈表達(dá)載體和輕鏈表達(dá)載體匹配，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞表達(dá)抗體，收取細(xì)胞上清檢測(cè)抗體效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)圖4．結(jié)果顯示24個(gè)抗體中，克隆19，20，21，22，23能特異性和人cGAS(161－522)蛋白結(jié)合．為進(jìn)一步確定抗體效價(jià)，將抗體克隆23進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)�結(jié)果見(jiàn)圖5，ELISA結(jié)果檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抗體克隆23滴度達(dá)到在1∶10000，具有良好的活性．圖4ELISA測(cè)定細(xì)胞上清表達(dá)抗體效價(jià)Fig.4MeasurementofantibodyserumtiterofcellculturemediumbyELISA圖5ELISA檢測(cè)B細(xì)胞克隆23的抗體效價(jià)Fig.5MeasurementantibodytiterofBcellclone23byELISA3討論從兔外周血B細(xì)胞中篩選兔單克隆抗體的技術(shù)，較傳統(tǒng)雜交瘤方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)．使用單B細(xì)胞技術(shù)擴(kuò)增單克隆抗體，可省略B細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的時(shí)間，更快速地獲得有效的抗體;同時(shí)也極大的節(jié)約成本．該方法不依賴(lài)于飼養(yǎng)細(xì)胞，因此它不僅可應(yīng)用于兔外周血B細(xì)胞，還可以應(yīng)用于多個(gè)物種，包括小鼠、人類(lèi)等［25］．單個(gè)B細(xì)胞抗體技術(shù)制備技術(shù)已經(jīng)成為制備抗體的熱門(mén)方法．隨著B(niǎo)細(xì)胞的分選技術(shù)、PCＲ擴(kuò)增方法以及抗體特異性、親和力鑒定方法的成熟和完善，未來(lái)單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)將在診斷、臨床應(yīng)用中發(fā)揮重大的作用．環(huán)狀GMP-AMP合成酶(cyclicGMP-AMPsynthase，cGAS)是細(xì)胞內(nèi)重要的DNA感受器，可激活下游的炎癥通路．最近研究表明，用依托泊苷(etoposide)、喜樹(shù)堿(camptothecin)和過(guò)氧化氫(H2O2)三種藥物處理三種人成纖維細(xì)胞?

cGAS抗體的表達(dá)及鑒定將重組重鏈表達(dá)載體和輕鏈表達(dá)載體匹配，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞表達(dá)抗體，收取細(xì)胞上清檢測(cè)抗體效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)圖4．結(jié)果顯示24個(gè)抗體中，克隆19，20，21，22，23能特異性和人cGAS(161－522)蛋白結(jié)合．為進(jìn)一步確定抗體效價(jià)，將抗體克隆23進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)�結(jié)果見(jiàn)圖5，ELISA結(jié)果檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抗體克隆23滴度達(dá)到在1∶10000，具有良好的活性．圖4ELISA測(cè)定細(xì)胞上清表達(dá)抗體效價(jià)Fig.4MeasurementofantibodyserumtiterofcellculturemediumbyELISA圖5ELISA檢測(cè)B細(xì)胞克隆23的抗體效價(jià)Fig.5MeasurementantibodytiterofBcellclone23byELISA3討論從兔外周血B細(xì)胞中篩選兔單克隆抗體的技術(shù)，較傳統(tǒng)雜交瘤方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)．使用單B細(xì)胞技術(shù)擴(kuò)增單克隆抗體，可省略B細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的時(shí)間，更快速地獲得有效的抗體;同時(shí)也極大的節(jié)約成本．該方法不依賴(lài)于飼養(yǎng)細(xì)胞，因此它不僅可應(yīng)用于兔外周血B細(xì)胞，還可以應(yīng)用于多個(gè)物種，包括小鼠、人類(lèi)等［25］．單個(gè)B細(xì)胞抗體技術(shù)制備技術(shù)已經(jīng)成為制備抗體的熱門(mén)方法．隨著B(niǎo)細(xì)胞的分選技術(shù)、PCＲ擴(kuò)增方法以及抗體特異性、親和力鑒定方法的成熟和完善，未來(lái)單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)將在診斷、臨床應(yīng)用中發(fā)揮重大的作用．環(huán)狀GMP-AMP合成酶(cyclicGMP-AMPsynthase，cGAS)是細(xì)胞內(nèi)重要的DNA感受器，可激活下游的炎癥通路．最近研究表明，用依托泊苷(etoposide)、喜樹(shù)堿(camptothecin)和過(guò)氧化氫(H2O2)三種藥物處理三種人成纖維細(xì)胞，均發(fā)現(xiàn)DNA損傷可使cGAS核轉(zhuǎn)位增加．Co-IP實(shí)驗(yàn)提示cGAS的核轉(zhuǎn)位可能
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