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NGAL特異性核酸適配子的篩選及初步應(yīng)用

發(fā)布時(shí)間:2024-07-08 20:40
  目的:中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)是早期診斷和預(yù)測(cè)急性腎損傷(AKI)的標(biāo)志物,而且調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但目前針對(duì)NAGL的檢測(cè)項(xiàng)目并未在臨床上廣泛開(kāi)展,也沒(méi)有以NGAL為靶點(diǎn)蛋白研發(fā)的抗腫瘤藥物。核酸適配子是一類(lèi)高特異性高親和力結(jié)合靶標(biāo)的單鏈DNA或RNA,在診斷和治療中廣泛應(yīng)用。本研究擬通過(guò)磁珠SELEX,篩選與NGAL高特異性高親和力結(jié)合的核酸適配子,一方面用于建立可廣泛推廣、簡(jiǎn)便低廉用于臨床診斷的酶聯(lián)適配子分析(ELAA)檢測(cè)方法;另一方面,初步探索NGAL特異性核酸適配子能否調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖,為抗腫瘤藥物研發(fā)提供一個(gè)新思路。方法:(1)通過(guò)磁珠SELEX篩選NGAL特異性核酸適配子,生物信息學(xué)方法對(duì)適配子進(jìn)行序列同源性分析和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),qPCR法驗(yàn)證比較候選適配子及適配子對(duì)NGAL的特異性和親和力。(2)選取最優(yōu)適配子A53替換ELISA中的第二個(gè)抗體,建立ELAA檢測(cè)方法,并進(jìn)行性能評(píng)價(jià),包括特異性、線性范圍、靈敏度、精密度、準(zhǔn)確性及臨床樣本檢測(cè)。(3)通過(guò)免疫熒光驗(yàn)證A53與食管鱗癌細(xì)胞KYSE45表達(dá)的NGAL的特異性結(jié)合,克隆形成實(shí)驗(yàn)和CC...

【文章頁(yè)數(shù)】:72 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】:碩士

【部分圖文】:

圖1磁珠SELEX篩選策略??

圖1磁珠SELEX篩選策略??

(2)磁珠SELEX篩選NGAL特異性適配子策略:??本研究的篩選策略是采用蛋白篩選中較為經(jīng)典成熟的磁珠SELEX來(lái)篩選??靶標(biāo)NGAL的特異性核酸適配子。具體策略如圖1:①包被NGAL的磁珠與??ssDNA庫(kù)孵育進(jìn)行SELEX篩選,并從第三輪開(kāi)始在每輪篩選之前加入裸磁珠??進(jìn)行....


圖2?ELAA檢測(cè)策略??

圖2?ELAA檢測(cè)策略??

或多個(gè)適配子及待測(cè)靶標(biāo)形成三明治夾心結(jié)構(gòu)的分析模式,其原理與EL1SA相??似。本研宄用NGAL最優(yōu)適配子A53替代EL1SA中的第二個(gè)抗體建立了?ELAA??檢測(cè)方法,具體檢測(cè)策略如圖2:①將NGAL抗體包被于96孔板上,用3%?BSA??封閉;②加入NGAL溶液孵育洗滌;③加....


圖3,Sllt的DNA庫(kù)

圖3,Sllt的DNA庫(kù)

第二章材料和方法第二章材料和方法??材料??單鏈DNA(ssDNA)庫(kù)的設(shè)計(jì)和合成??用兩端各為20nt的固定的引物互補(bǔ)序列,中間為355nt的封閉型的ssDNA庫(kù)(圖3),庫(kù)容量大約1021,:??CAGAGGTCAGATG-N35-CCTATGCGTGCTACCG-N-N?N....


圖4?NGAL驗(yàn)證及包被結(jié)果??A,考馬斯亮藍(lán)染色驗(yàn)證NGAL純度;B,?BCA法測(cè)定蛋白包被前后上清溶液蛋白濃度,t??

圖4?NGAL驗(yàn)證及包被結(jié)果??A,考馬斯亮藍(lán)染色驗(yàn)證NGAL純度;B,?BCA法測(cè)定蛋白包被前后上清溶液蛋白濃度,t??

干粉加入500叫ddw溶解后,用Pierce??BCA?Protein?Assay?Kit測(cè)其濃度為??1.06明/叫與說(shuō)明書(shū)一致。取lO^LNGAL經(jīng)12%?SDS?PAGE膠電泳后考馬斯亮藍(lán)??染色,結(jié)果如圖4A,位于25kD左右顯示明亮清晰的NGAL條帶,條帶大小與說(shuō)??明....



本文編號(hào):4003847

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