目的:中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)是早期診斷和預(yù)測急性腎損傷(AKI)的標(biāo)志物,而且調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但目前針對NAGL的檢測項(xiàng)目并未在臨床上廣泛開展,也沒有以NGAL為靶點(diǎn)蛋白研發(fā)的抗腫瘤藥物。核酸適配子是一類高特異性高親和力結(jié)合靶標(biāo)的單鏈DNA或RNA,在診斷和治療中廣泛應(yīng)用。本研究擬通過磁珠SELEX,篩選與NGAL高特異性高親和力結(jié)合的核酸適配子,一方面用于建立可廣泛推廣、簡便低廉用于臨床診斷的酶聯(lián)適配子分析(ELAA)檢測方法;另一方面,初步探索NGAL特異性核酸適配子能否調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖,為抗腫瘤藥物研發(fā)提供一個(gè)新思路。方法:(1)通過磁珠SELEX篩選NGAL特異性核酸適配子,生物信息學(xué)方法對適配子進(jìn)行序列同源性分析和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,qPCR法驗(yàn)證比較候選適配子及適配子對NGAL的特異性和親和力。(2)選取最優(yōu)適配子A53替換ELISA中的第二個(gè)抗體,建立ELAA檢測方法,并進(jìn)行性能評價(jià),包括特異性、線性范圍、靈敏度、精密度、準(zhǔn)確性及臨床樣本檢測。(3)通過免疫熒光驗(yàn)證A53與食管鱗癌細(xì)胞KYSE45表達(dá)的NGAL的特異性結(jié)合,克隆形成實(shí)驗(yàn)和CC...

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１磁珠ＳＥＬＥＸ篩選策略??

（２）磁珠ＳＥＬＥＸ篩選ＮＧＡＬ特異性適配子策略：??本研究的篩選策略是采用蛋白篩選中較為經(jīng)典成熟的磁珠ＳＥＬＥＸ來篩選??靶標(biāo)ＮＧＡＬ的特異性核酸適配子。具體策略如圖１：①包被ＮＧＡＬ的磁珠與??ｓｓＤＮＡ庫孵育進(jìn)行ＳＥＬＥＸ篩選，并從第三輪開始在每輪篩選之前加入裸磁珠??進(jìn)行....

圖２?ＥＬＡＡ檢測策略??

或多個(gè)適配子及待測靶標(biāo)形成三明治夾心結(jié)構(gòu)的分析模式，其原理與ＥＬ１ＳＡ相??似。本研宄用ＮＧＡＬ最優(yōu)適配子Ａ５３替代ＥＬ１ＳＡ中的第二個(gè)抗體建立了?ＥＬＡＡ??檢測方法，具體檢測策略如圖２：①將ＮＧＡＬ抗體包被于９６孔板上，用３％?ＢＳＡ??封閉；②加入ＮＧＡＬ溶液孵育洗滌；③加....

圖3，Sllt的DNA庫

第二章材料和方法第二章材料和方法??材料??單鏈ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）庫的設(shè)計(jì)和合成??用兩端各為２０ｎｔ的固定的引物互補(bǔ)序列，中間為３５５ｎｔ的封閉型的ｓｓＤＮＡ庫（圖３），庫容量大約１０２１，：??ＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＴＧ－Ｎ３５－ＣＣＴＡＴＧＣＧＴＧＣＴＡＣＣＧ－Ｎ－Ｎ?Ｎ....

圖４?ＮＧＡＬ驗(yàn)證及包被結(jié)果??Ａ，考馬斯亮藍(lán)染色驗(yàn)證ＮＧＡＬ純度；Ｂ，?ＢＣＡ法測定蛋白包被前后上清溶液蛋白濃度，ｔ??

干粉加入５００叫ｄｄｗ溶解后，用Ｐｉｅｒｃｅ？?ＢＣＡ?Ｐｒｏｔｅｉｎ?Ａｓｓａｙ?Ｋｉｔ測其濃度為??１．０６明／叫與說明書一致。取ｌＯ＾ＬＮＧＡＬ經(jīng)１２％?ＳＤＳ?ＰＡＧＥ膠電泳后考馬斯亮藍(lán)??染色，結(jié)果如圖４Ａ，位于２５ｋＤ左右顯示明亮清晰的ＮＧＡＬ條帶，條帶大小與說??明....

本文編號：4003847