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NGAL特異性核酸適配子的篩選及初步應用

發(fā)布時間:2024-07-08 20:40
  目的:中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)是早期診斷和預測急性腎損傷(AKI)的標志物,而且調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但目前針對NAGL的檢測項目并未在臨床上廣泛開展,也沒有以NGAL為靶點蛋白研發(fā)的抗腫瘤藥物。核酸適配子是一類高特異性高親和力結(jié)合靶標的單鏈DNA或RNA,在診斷和治療中廣泛應用。本研究擬通過磁珠SELEX,篩選與NGAL高特異性高親和力結(jié)合的核酸適配子,一方面用于建立可廣泛推廣、簡便低廉用于臨床診斷的酶聯(lián)適配子分析(ELAA)檢測方法;另一方面,初步探索NGAL特異性核酸適配子能否調(diào)節(jié)腫瘤細胞的惡性增殖,為抗腫瘤藥物研發(fā)提供一個新思路。方法:(1)通過磁珠SELEX篩選NGAL特異性核酸適配子,生物信息學方法對適配子進行序列同源性分析和二級結(jié)構(gòu)預測,qPCR法驗證比較候選適配子及適配子對NGAL的特異性和親和力。(2)選取最優(yōu)適配子A53替換ELISA中的第二個抗體,建立ELAA檢測方法,并進行性能評價,包括特異性、線性范圍、靈敏度、精密度、準確性及臨床樣本檢測。(3)通過免疫熒光驗證A53與食管鱗癌細胞KYSE45表達的NGAL的特異性結(jié)合,克隆形成實驗和CC...

【文章頁數(shù)】:72 頁

【學位級別】:碩士

【部分圖文】:

圖1磁珠SELEX篩選策略??

圖1磁珠SELEX篩選策略??

(2)磁珠SELEX篩選NGAL特異性適配子策略:??本研究的篩選策略是采用蛋白篩選中較為經(jīng)典成熟的磁珠SELEX來篩選??靶標NGAL的特異性核酸適配子。具體策略如圖1:①包被NGAL的磁珠與??ssDNA庫孵育進行SELEX篩選,并從第三輪開始在每輪篩選之前加入裸磁珠??進行....


圖2?ELAA檢測策略??

圖2?ELAA檢測策略??

或多個適配子及待測靶標形成三明治夾心結(jié)構(gòu)的分析模式,其原理與EL1SA相??似。本研宄用NGAL最優(yōu)適配子A53替代EL1SA中的第二個抗體建立了?ELAA??檢測方法,具體檢測策略如圖2:①將NGAL抗體包被于96孔板上,用3%?BSA??封閉;②加入NGAL溶液孵育洗滌;③加....


圖3,Sllt的DNA庫

圖3,Sllt的DNA庫

第二章材料和方法第二章材料和方法??材料??單鏈DNA(ssDNA)庫的設(shè)計和合成??用兩端各為20nt的固定的引物互補序列,中間為355nt的封閉型的ssDNA庫(圖3),庫容量大約1021,:??CAGAGGTCAGATG-N35-CCTATGCGTGCTACCG-N-N?N....


圖4?NGAL驗證及包被結(jié)果??A,考馬斯亮藍染色驗證NGAL純度;B,?BCA法測定蛋白包被前后上清溶液蛋白濃度,t??

圖4?NGAL驗證及包被結(jié)果??A,考馬斯亮藍染色驗證NGAL純度;B,?BCA法測定蛋白包被前后上清溶液蛋白濃度,t??

干粉加入500叫ddw溶解后,用Pierce??BCA?Protein?Assay?Kit測其濃度為??1.06明/叫與說明書一致。。欤希蓿蹋危牵粒探(jīng)12%?SDS?PAGE膠電泳后考馬斯亮藍??染色,結(jié)果如圖4A,位于25kD左右顯示明亮清晰的NGAL條帶,條帶大小與說??明....



本文編號:4003847

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