發(fā)布時間：2020-11-13 09:29

　　 目的分析脂肪基質細胞(Adipose-derived stromal cells,ADSC)誘導分化為星形膠質細胞過程中內質網(wǎng)應激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)的特征,從而明確ERS在這種誘導分化反應中的作用。方法1將ADSC從成人離體脂肪組織中提取后,進行傳代與培養(yǎng),選取生長狀態(tài)良好的第3代ADSC,用DE-1誘導劑對其進行誘導分化,獲得未誘導組及誘導48h、7d、14d、21d組細胞。倒置相差顯微鏡觀察不同誘導時間組細胞的形態(tài)變化,并攝片存檔。2免疫細胞化學技術檢測ADSC未誘導組及各時間誘導組膠質纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內質網(wǎng)激酶(PKR-like ER kinase,PERK)、活化轉錄因子6(Activating transcription factor6,ATF6)、葡萄糖調節(jié)蛋白(Glucose-regulated protein,GRP78/BiP)、和細胞凋亡蛋白增強子結合蛋白同源蛋白(Enhancer-binding protein-homologous proein,CHOP/GADDl53)、半胱天冬氨酸蛋白酶12(Cysteme aspartate specific protease 12,Caspase12)和半胱天冬氨酸蛋白酶3(Cysteme aspartate specific protease 3,Caspase3)的表達情況。3 Western-blotting法定量檢測ADSC在未誘導組及各時間誘導組中GFAP、PERK、ATF6、GRP78、CHOP、Caspase12和Caspase3的表達水平。4免疫熒光化學法檢測ADSC向星形膠質細胞誘導過程中GFAP與PERK、ATF6、GRP78、CHOP、Caspase12和Caspase3的共表達特征。5統(tǒng)計學分析:將全部實驗數(shù)據(jù)應用Excel 2007建立數(shù)據(jù)庫,應用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件對全部數(shù)據(jù)進行分析,計量資料以均數(shù)±標準差(sx±)表示,各組不同時間點間的比較采用單因素方差分析(one way ANOVA),各誘導水平之間的多重比較(兩兩比較)用LSD進行檢驗,以P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。結果1原代ADSC培養(yǎng)24h呈類圓形、錐形或短棒狀,均勻貼壁生長;第3代第5天的ADSC呈長梭形,纖維細胞狀,兩端長突起纖細變長;ADSC誘導48h時形態(tài)不規(guī)則,兩端長突起回縮,胞體伸出少量短小突起。誘導第7d時,胞體呈類圓形,突起變長,且數(shù)量增多,圍繞胞體呈放射狀生長。誘導14d時,胞體呈圓形或不規(guī)則形,胞體突起更加纖長,末端分叉生長。誘導21d時大部分ADSC凋亡,胞體的細胞膜破裂,突起回縮、斷裂、數(shù)量減少。2免疫細胞化學法檢測發(fā)現(xiàn),ADSC未誘導組不表達GFAP,誘導48h、7d、14d、21d組均有陽性表達細胞,且其細胞陽性表達率在誘導14d明顯高于其它各組(均P0.001),PERK、ATF6和GRP78在未誘導組和誘導各時間組均有陽性表達細胞,未誘導組細胞陽性表達率明顯高于誘導各時間組,且隨誘導時間延長而明顯逐漸降低(均P0.001),CHOP、Caspase12和Caspase3在各組細胞組均可見陽性表達,而且其細胞陽性表達率隨誘導時間的增長而逐漸增高,均在未誘導組最低,在誘導21d組最高(均P0.001)。3 Western-blotting法定量檢測發(fā)現(xiàn),未誘導組沒有GFAP表達,誘導14d組表達水平明顯高于48h、7d、21d組(均P0.001);各組均檢測到PERK、ATF6、GRP78、CHOP、Caspase12和Caspase3的表達,PERK在未誘導組表達水平明顯高于其它各組(P0.001),各組之間兩兩比較均有明顯統(tǒng)計學差異(均P0.05),ATF6和GRP78的表達在未誘導組達峰值(均P0.001),誘導7d組與48h組無差異,其余各組間兩兩比較均有統(tǒng)計學差異(均P0.05),CHOP表達水平在誘導21d組明顯高于其它各時間組(均P0.01),Caspase12表達水平在未誘導組與誘導48h組之間無差異,在誘導7d組與14d組之間也無差異性,但在其余各組之間的差異有統(tǒng)計學意義(均P0.05),Caspase3表達水平在誘導14d組與7d組無統(tǒng)計學差異,其余各組之間均有統(tǒng)計學差異性(均P0.05)。4免疫熒光化學法檢測結果顯示,在未誘導組無GFAP的綠色熒光陽性表達,但可見PERK、ATF6、GRP78、CHOP、Caspase12和Caspase3的紅色熒光陽性表達。在誘導48h、7d、14d、21d組均可見GFAP/GRP78、GFAP/PERK、GFAP/ATF6、GFAP/CHOP、GFAP/Caspase12和GFAP/Caspase3的熒光共定位陽性表達。PERK、ATF6和GRP78的細胞陽性表達率隨誘導反應時間延長而降低,未誘導組明顯高于其它時間組(均P0.01),CHOP、Caspase12和Caspase3的細胞陽性表達率則隨誘導時間延長而升高,在未誘導組最低,在誘導21d組最高(均P0.01)。結論在ADSC誘導分化為星形膠質細胞的過程中發(fā)生了內質網(wǎng)應激,且內質網(wǎng)應激引發(fā)的由ATF6和PERK信號通路介導的未折疊蛋白反應明顯減弱,而內質網(wǎng)途徑介導的細胞凋亡明顯增強,特別是在誘導14d后急劇增加,是導致分化細胞死亡的主要原因。
【學位單位】：華北理工大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R329.2
【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮略表
引言
第1章 實驗研究
    1.1 材料與方法
        1.1.1 材料
        1.1.2 實驗方法
    1.2 結果
        1.2.1 ADSC的培養(yǎng)和誘導為星形膠質細胞過程中的細胞形態(tài)學變化特征
        1.2.2 免疫細胞化學法檢測ADSC向星形膠質細胞誘導過程中GFAP,PERK,ATF6,GRP78,CHOP,Caspase12和Caspase3的表達結果
        1.2.3 Western-blotting法檢測ADSC向星形膠質細胞誘導過程中GFAP、PERK、ATF6、GRP78、CHOP、Caspase12和Caspase3的表達水平
        1.2.4 免疫熒光化學法檢測ADSC向星形膠質細胞誘導過程中GFAP與PERK,ATF6,GRP78,CHOP,Caspase12和Caspase3共表達特征
    1.3 討論
    1.4 結論
    參考文獻
第2章 綜述 ADSC源性星形膠質細胞內質網(wǎng)應激研究進展
    2.1 內質網(wǎng)應激反應
        2.1.1 內質網(wǎng)應激的起始-未折疊蛋白反應
        2.1.2 內質網(wǎng)應激的監(jiān)測者-葡萄糖調節(jié)蛋白
    2.2 .內質網(wǎng)應激的促細胞存活通路
        2.2.1 PERK介導的生存信號PERK-eIF2α途徑
        2.2.2 IRE1信號生存通路IRE1-XBP1途徑
        2.2.3 ATF6途徑
    2.3 .內質網(wǎng)應激的促細胞凋亡通路
        2.3.1 轉錄因子CHOP/GADD153的激活
        2.3.2 c-Jun氨基末端激酶的激活
        2.3.3 Caspase12蛋白酶途徑的激活
        2.3.4 B淋巴細胞瘤-2家族成員和鈣離子信號
    2.4 結語
    參考文獻
結論
附錄 圖片
致謝
導師簡介
作者簡介
學位論文數(shù)據(jù)集

【參考文獻】

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本文編號：2882042