發(fā)布時間：2020-11-13 06:07

　　 背景食管癌已經(jīng)成為全世界第八大惡性腫瘤和第六位癌癥相關(guān)死亡的主要病因,大多數(shù)食管癌患者診斷時為晚期,腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移。長期或大劑量使用化療藥物易導(dǎo)致腫瘤耐藥。Sirtuin1(SIRT1)屬于哺乳動物sirtuin家族,由于在組蛋白和非組蛋白去乙酰化方面發(fā)揮重要作用,因此作為人類疾病的治療靶標(biāo)受到廣泛關(guān)注,特別是對癌癥方面的治療。2005年,Elixir制藥公司的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了第一種選擇性吲哚結(jié)構(gòu)的SIRT1抑制劑EX527,其IC50值為98 nM。目前為止,EX527仍是最有效的SIRT1選擇性抑制劑。EX527與sirtuins結(jié)合發(fā)生在亞氨酸酯中間體形成和煙酰胺釋放后,EX527抑制SIRT1活性的主要機制是阻斷核糖-sirtuin復(fù)合物的形成。然而,SIRT1的抑制劑EX527是否對耐藥腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲有影響尚不清楚。該研究考察EX527對耐藥食管癌細(xì)胞(EC109/PTX、TE-1/PTX)的遷移和侵襲能力的影響,并初步揭示SIRT1參與調(diào)控耐藥食管癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的作用機制,為臨床治療食管癌耐藥及轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。方法(1)MTT實驗驗證EC109/PTX和TE-1/PTX細(xì)胞對紫杉醇的敏感性;劃痕和Transwell實驗檢測親本及耐藥細(xì)胞的遷移能力;Western blotting實驗檢測親本細(xì)胞與耐藥細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達;建立裸鼠皮下移植瘤模型,免疫組化實驗檢測EC109、EC109/PTX、TE-1、TE-1/PTX腫瘤組織中EMT相關(guān)蛋白的表達;Western blotting檢測細(xì)胞耐藥前后SIRT1、H4K16ac、P53ac的表達。(2)SIRT1抑制劑EX527對耐藥食管癌細(xì)胞克隆形成的影響;Si RNA干擾SIRT1后H4K16ac、P53ac在耐藥食管癌細(xì)胞中的表達;抑制劑EX527或Si RNA干擾SIRT1后,劃痕和Transwell實驗檢測耐藥細(xì)胞的遷移性。Western blotting及免疫熒光檢測抑制SIRT1前后耐藥細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的表達;皮下接種移植瘤,腹腔注射EX527觀察EX527對皮下移植瘤的抑制作用。結(jié)果(1)耐藥食管癌細(xì)胞EC109/PTX、TE-1/PTX具有更強的遷移侵襲能力。通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)紫杉醇對EC109/PTX細(xì)胞的IC_(50)是對其親本細(xì)胞的5.18倍;TE-1/PTX細(xì)胞的IC_(50)是對其親本細(xì)胞的6.40倍。劃痕和Transwell實驗發(fā)現(xiàn)細(xì)胞耐藥后其遷移能力明顯比其相應(yīng)的親本細(xì)胞強。Western blotting實驗及免疫熒光證實細(xì)胞耐藥后EMT相關(guān)蛋白中N-cadherin、vimentin、snail的表達量明顯升高。建立裸鼠皮下移植瘤模型,免疫組化檢測腫瘤組織中EMT相關(guān)蛋白表達與體外實驗結(jié)果一致,細(xì)胞耐藥后N-cadherin、vimentin、snail的表達量升高。SIRT1在耐藥食管癌細(xì)胞中表達量沒有顯著性差異,但細(xì)胞耐藥后SIRT1下游蛋白H4K16ac、P53ac表達下降,說明SIRT1的去乙酰化活性增強。(2)抑制SIRT1的表達能抑制耐藥食管癌細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化。SIRT1的抑制劑EX527能抑制EC109/PTX和TE-1/PTX細(xì)胞集落形成。Si RNA或EX527干擾SIRT1后,劃痕和Transwell實驗發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞侵襲遷移能力被抑制。抑制SIRT1后,Western blotting、免疫熒光和免疫組化發(fā)現(xiàn)N-cadherin、snail蛋白表達下調(diào),而E-cadherin表達上調(diào)。皮下接種移植瘤,腹腔注射EX527(5 mg/kg)可抑制TE-1/PTX的裸鼠瘤體積。結(jié)論綜上所述,通過從體內(nèi)外兩方面證明食管癌細(xì)胞(EC109、TE-1)耐藥后,其侵襲遷移能力增強伴隨著上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程;抑制劑EX527抑制SIRT1可以顯著降低耐藥食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力,進一步機制研究發(fā)現(xiàn)干擾SIRT1可以調(diào)控細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)進程,改變細(xì)胞形態(tài),調(diào)控耐藥細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R965;R-332
【部分圖文】：

（2）48 h 后收集細(xì)胞，1000 rpm 離心 4 min，棄去上清后加入 PBS 清洗細(xì)胞向每管細(xì)胞中加入 100 μL 左右的 RIPA 裂解液（含全蛋白酶抑制劑、磷酸酶制劑、PMSF）。（3）樣品置于冰上裂解，每隔 10 min 吹打細(xì)胞一次，使細(xì)胞充分裂解。樣品解 30 min 后放置低溫高速離心機中離心（12000 rpm×10 min）。（4）將離心后的上清液吸至另一標(biāo)記好的 1.5 mL 的離心管中，并記錄液體的積。2.2.5.2 BCA 法測定蛋白濃度以及蛋白變性（1）BCA 工作液的配制：將工作液 A：B 以 50：1 的比例混合，室溫放置待（2）繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線：取不同體積終濃度為 0.5 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋使每個孔的蛋白濃度最終分別為 0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00、1μg/μL，不足部分補加 PBS 構(gòu)成 20 μL 體系，每個濃度設(shè) 3 個復(fù)孔。每孔加入μL 配好的 BCA 工作液，37 ℃恒溫孵育 20 min。酶標(biāo)儀在 562 nm 波長處檢吸光度，根據(jù)吸光度值和蛋白濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)方程。如圖 2.1

該部分?jǐn)?shù)據(jù)研究采用 SPSS13.0 軟件分析。兩組的組間分析采用 Students ttest。所有數(shù)值均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD），雙側(cè)檢驗 P 值＜0.05 認(rèn)為有數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)差異。2.3 實驗結(jié)果2.3.1 耐藥細(xì)胞對紫杉醇的敏感性降低檢測不同濃度的 PTX 對 EC109、EC109/PTX、TE-1、TE-1/PTX 細(xì)胞作用48 h 后細(xì)胞活力變化。在同一濃度的 PTX 作用下，耐藥細(xì)胞組的細(xì)胞活力明顯高于其親本細(xì)胞組（圖 2.1A，B）。實驗數(shù)據(jù)表明，EC109 細(xì)胞的半數(shù)抑制率 IC50約為 371 nM，EC109/PTX 的 IC50約為 1926 nM，耐藥細(xì)胞是親本細(xì)胞的 5.19 倍；TE-1、TE-1/PTX 細(xì)胞的 IC50分別為 348 nM、2228 nM，耐藥細(xì)胞 IC50是親本細(xì)胞的 6.40 倍（表 2.1）。

食管癌細(xì)胞耐藥后轉(zhuǎn)移侵襲能力及 SIRT1 的表達2.3.2 細(xì)胞耐藥后遷移能力增強通過細(xì)胞劃痕實驗測定 24 h 和 48 h 后 EC109、EC109/PTX、TE-1、TE-1/PTX細(xì)胞遷移能力的變化。結(jié)果表明耐藥食管癌細(xì)胞株細(xì)胞遷移能力更強（圖 2.2A）。測量劃痕寬度的變化進行統(tǒng)計，48 h 后 EC109 細(xì)胞的劃痕寬度是 EC109/PTX 細(xì)胞的 1.50 倍，這說明 EC109/PTX 細(xì)胞的遷移能力強于 EC109 細(xì)胞。TE-1 及TE-1/PTX 細(xì)胞在劃痕 24 h 后實驗結(jié)果具有顯著性差異，TE-1 細(xì)胞的劃痕寬度為（12.00±1.25），TE-1/PTX 細(xì)胞劃痕寬度為（5.20±1.03），TE-1/PTX 細(xì)胞是TE-1 細(xì)胞的 2.30 倍（圖 2.2 B）。
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