發(fā)布時(shí)間：2020-11-06 00:45

　　 目的:探討Drp1與BAX共定位線粒體調(diào)節(jié)皮層神經(jīng)元凋亡損傷的作用。材料與方法:體外培養(yǎng)新生24h內(nèi)SD大鼠皮層神經(jīng)元,分為空白組(A組)、DMSO溶劑組(B組)、谷氨酸鈉組(C組)、Mdivi-1預(yù)處理+谷氨酸鈉組(D組),beta III tubulin和MAP2熒光檢測鑒定神經(jīng)元,JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位,Western Blot分別分析皮層神經(jīng)元全細(xì)胞提取液、胞質(zhì)內(nèi)及線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C、Casapse-3、Drp1、p-Drp1、BAX的表達(dá)情況,免疫熒光染色檢測Drp1和BAX的表達(dá)及其與線粒體位置關(guān)系。結(jié)果:Beta III tubulin和MAP2熒光結(jié)果清晰顯示了神經(jīng)元的特有形態(tài);JC-1染色結(jié)果顯示,A、B組之間線粒體膜電位沒有明顯區(qū)別,與之相比,C、D組的線粒體膜電位降低明顯,C組尤其明顯。Westen blot結(jié)束示:全細(xì)胞提取液中C組BAX、Drp1、Caspase-3明顯增加且D組增加程度不如C組明顯,p-Drp1與Drp1的變化趨勢相反;胞質(zhì)內(nèi)C、D組中BAX、Drp1、Cyto-C明顯增加且C組為著,p-Drp1與Drp1的變化趨勢相反;線粒體提取液中C和D組BAX和Drp1明顯增加且C組更為明顯,A、B、C、D四組的p-Drp1表達(dá)量均很低,C和D組Cyto-C明顯減少且C組更為明顯。Drp1和BAX的熒光結(jié)果顯示,熒光強(qiáng)度的變化趨勢與Westen blot定量結(jié)果的變化趨勢一致,且隨著Drp1和BAX表達(dá)增加,兩者共定位于線粒體趨勢更為明顯。結(jié)論:線粒體膜是動態(tài)變化的結(jié)構(gòu),線粒體作為細(xì)胞重要的細(xì)胞器之一,為細(xì)胞提供能量,其結(jié)構(gòu)完整與功能正常對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。神經(jīng)元凋亡損傷過程中,BAX表達(dá)增加,p-Drp1去磷酸化為Drp1,BAX和Drp1共同聚集于線粒體,增加線粒體膜通透性,促進(jìn)線粒體分裂,降低線粒體膜電位,促進(jìn)Cyto-C從線粒體釋放并激活Caspase-3介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Mdivi-1可以抑制p-Drp1的去磷酸化以及Drp1和BAX共定位,對谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)毒性起保護(hù)作用,穩(wěn)定線粒體膜電位,抑制線粒體內(nèi)Cyto-C的釋放及對Caspase-3的激活,抑制神經(jīng)元凋亡損傷。
【學(xué)位單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R338
【部分圖文】：

圖 1.免疫熒光染色神經(jīng)元鑒定（7d），細(xì)胞胞體飽滿，神經(jīng)元突觸明顯且相互交織構(gòu)成神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，microtubule-associated protein 2（MAP2）（A1、A2、A3）和 beta III tubulin （B1、B2、B3）。圖 A1 (200×)， A2 (400×)， A3 (400×).MAP2 (紅)， DAPI (藍(lán)). B1 (200×)， B2 (400×)， B3 (400×). Beta III tubulin(紅)， DAPI (藍(lán))。2 線粒體膜電位檢測細(xì)胞分組處理后，JC-1 探針觀察線粒體膜電位，JC-1 探針有兩種存狀態(tài)，聚合體和單體形態(tài)，線粒體膜電位正常是，JC-1 以聚合體形式存在，發(fā)出紅色的熒光，而當(dāng)線粒體受凋亡因子刺激下，線粒體膜電位下降，JC-1 探針以單體形式發(fā)出綠色熒光，與 A、B 組相比，C、D 組細(xì)胞 Monomer 特有的綠色熒光明顯增強(qiáng)，尤以 C 組為著。谷氨酸誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，線粒體膜內(nèi)外的電位勢能無法維持正常，而使用 Drp1 的抑制劑 Mdivi-1 可以抑制線粒體分裂，能夠減輕谷氨酸鹽對線粒體膜電位的影響（圖 2）。

圖 2.線粒體膜電位：JC-1 為熒光探針，可以快速、靈敏地檢測細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，能夠用于早期的細(xì)胞凋亡檢測。JC-1 是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential)△Ψm 的理想熒光探針，在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1 聚集在線粒體基質(zhì)中，聚合物可以產(chǎn)生明亮的紅色熒光；線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1 不能以聚合物形式存在于線粒體基質(zhì)，單體形式的 JC-1(monomer)可以產(chǎn)生綠色熒光。熒光顏色的變化可以直觀體現(xiàn)出線粒體膜電位的變化，線粒體膜電位下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。3 免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果3.1 谷氨酸鹽激活 Drp1 并促進(jìn)其向線粒體募集谷氨酸鹽能夠加速 p-Drp1 (Ser637)去磷酸化，并且可以促進(jìn) Drp1 向線粒體募集，Drp1 是經(jīng)典的調(diào)節(jié)線粒體分裂的蛋白，生理狀態(tài)下以無活性的 637 位點(diǎn)磷酸化形式存在于胞質(zhì)內(nèi)，隨著細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變，功能 Drp1 和 p-Drp1 (Ser637

圖 4.1.COX IV 做為線粒體的 Maker，用于標(biāo)記線粒體的位置，紅色熒光為 Drp1，黃色熒光為兩者 Merge 點(diǎn)，藍(lán)色為 DAPI，黃色熒光表示募集于線粒體的 Drp1。COX IV BAX DAPI Merge MergeABC
【參考文獻(xiàn)】

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1 蔡鴻財(cái);宋樂彬;張國巍;卿興榮;莫敦勝;劉瑋;詹緒新;黃宇烽;商學(xué)軍;;夏荔芪膠囊對良性前列腺增生模型大鼠PCNA、caspase-3表達(dá)水平的影響[J];中華男科學(xué)雜志;2017年08期

2 Maya Otto-Duessel;Ben Yi Tew;Steven Vonderfecht;Roger Moore;Jeremy O Jones;;Identification of neuron selective androgen receptor inhibitors[J];World Journal of Biological Chemistry;2017年02期

本文編號：2872425