發(fā)布時間：2024-10-05 06:02

　　大黃魚(Larimichthys crocea)虹彩病毒病是當前危害大黃魚養(yǎng)殖業(yè)最為嚴重的幾種病害之一,多流行于夏季高溫季節(jié),一般幼齡魚多發(fā),死亡率最高可達50%以上,該病目前尚無有效的針對性治療方法。近年在大黃魚生產(chǎn)實際中,饑餓療法常被運用于大黃魚感染虹彩病毒病的治療,本實驗通過模擬臨床中大黃魚虹彩病毒病饑餓療法試驗,建立大黃魚人工感染虹彩病毒群體,分別連續(xù)饑餓和投喂一周,采用實時熒光定量PCR法在分子水平上開展了不同組織中病毒載量以及相關免疫因子表達情況的研究,同時對免疫酶、抗氧化酶等指標進行測定分析,研究結果如下:(1)根據(jù)OIE水生動物診斷手冊推薦的基因序列,成功構建虹彩病毒SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法,其最低檢出限為10～2 copies/ng DNA,質粒標準曲線的相關系數(shù)為99.82%,運用該方法對自然發(fā)病大黃魚體內病毒載量進行檢測,其主要免疫器官脾臟、頭腎和肝臟中病毒載量分別為8.90×10～4copies/ng DNA、1.86×10～4copies/ng DNA和1.32×10～4copies/ng DNA。(2)通過腹腔注射虹彩病毒懸液感染健康大...

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 引言
第二章 虹彩病毒SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法的建立
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗材料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器設備
        2.1.4 實驗所用溶液及其配置
    2.2 實驗方法
        2.2.1 特異性引物設計與合成
        2.2.2 組織DNA提取
        2.2.3 標準質粒的制備
        2.2.4 SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法的建立
        2.2.5 自然發(fā)病大黃魚定性檢測
        2.2.6 運用實時熒光定量法檢測自然發(fā)病大黃魚體內虹彩病毒載量
        2.2.7 數(shù)據(jù)處理
    2.3 結果
        2.3.1 虹彩病毒基因片段的克隆及測序鑒定
        2.3.2 重組質粒酶切鑒定及濃度測定
        2.3.3 熒光定量PCR反應條件的確定
        2.3.4 熒光定量PCR標準曲線的建立
        2.3.5 自然發(fā)病大黃魚樣品常規(guī)PCR檢測結果及qPCR結果
    2.4 討論與小結
        2.4.1 小結
        2.4.2 討論
第三章 大黃魚虹彩病毒人工感染群體建立
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗動物
        3.1.2 病毒株
        3.1.3 主要試劑及其配制
        3.1.4 主要儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 病毒懸液制備
        3.2.2 攻毒試驗
        3.2.3 虹彩病毒的PCR檢測
        3.2.4 組織病理學切片制備和觀察
    3.3 結果
        3.3.1 大黃魚人工感染虹彩病毒的臨床癥狀與PCR檢測
        3.3.2 人工感染的大黃魚組織病理學變化
        3.3.3 超微組織病理觀察結果
    3.4 討論與小結
        3.4.1 小結
        3.4.2 討論
第四章 饑餓對人工感染大黃魚體內虹彩病毒載量及抗病毒基因表達的影響
    4.1 實驗材料
        4.1.1 主要試劑
        4.1.2 主要儀器設備
    4.2 實驗方法
        4.2.1 實驗分組設計
        4.2.2 樣本采集
        4.2.3 RT引物設計
        4.2.4 DNA提取及濃度測定
        4.2.5 總RNA提取及cDNA合成
        4.2.6 熒光定量PCR檢測
        4.2.7 數(shù)據(jù)處理
    4.3 結果
        4.3.1 饑餓組與投喂組感染后死亡率統(tǒng)計
        4.3.2 微量分光光度計檢測DNA及 RNA純度
        4.3.3 IFNc、Mx和 IgM檢測引物的熔解曲線分析
        4.3.4 饑餓組與投喂組主要免疫器官中病毒載量的變化
        4.3.5 饑餓組與投喂組主要免疫器官中抗病毒基因的表達變化
    4.4 討論與小結
        4.4.1 小結
        4.4.2 討論
第五章 饑餓對人工感染大黃魚組織中SOD、CAT、ACP、AKP酶活性的影響
    5.1 實驗材料
        5.1.1 組織樣本
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 主要儀器設備
    5.2 實驗方法
        5.2.1 酶液的制備
        5.2.2 數(shù)據(jù)處理
    5.3 結果
        5.3.1 饑餓對人工感染大黃魚組織內SOD活力的影響
        5.3.2 饑餓對人工感染大黃魚組織內CAT活力的影響
        5.3.3 饑餓對人工感染大黃魚組織內ACP活力的影響
        5.3.4 饑餓對人工感染大黃魚組織內AKP活力的影響
    5.4 討論與小結
        5.4.1 小結
        5.4.2 討論
總結與展望
    總結
    不足和有待進一步研究的問題
參考文獻
致謝
在讀期間發(fā)表的學術論文及研究成果



本文編號：4007622