發(fā)布時間：2020-12-04 05:20

　　青貯是制備反芻動物飼料的重要方法,乳酸菌是青貯工藝的核心,是影響青貯飼料品質(zhì)的決定因素。篩選區(qū)域適應(yīng)性乳酸菌,定向、高效、安全地改造乳酸菌是當(dāng)前青貯研究的重要方向。纖維素轉(zhuǎn)化率低使得青貯飼料利用效率低,導(dǎo)致養(yǎng)殖成本增加。漆酶參與木質(zhì)素降解,提高纖維素轉(zhuǎn)化率。通過基因工程的方法構(gòu)建能夠分泌漆酶的乳酸菌,是提高飼料利用效率的有效手段。本文按照乳酸乳球菌NZ9000密碼子偏好性,優(yōu)化含有Usp45信號肽的枯草芽孢桿菌CotA漆酶基因序列（S-CotA）,在大腸桿菌中驗(yàn)證優(yōu)化后CotA漆酶表達(dá)活性,并將S-CotA漆酶基因與pMG36e載體連接,電轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌NZ9000,構(gòu)建出具有分泌漆酶能力的重組乳酸乳球菌。優(yōu)化重組菌株培養(yǎng)條件,表征漆酶酶學(xué)性質(zhì),考察重組乳酸乳球菌對青貯玉米秸稈品質(zhì)影響。主要結(jié)果如下:1.CotA漆酶基因與pET-30a（+）表達(dá)載體連接后轉(zhuǎn)化入E.coli Transetta（DE3）中。SDS-PAGE和Western Blot分析結(jié)果表明CotA漆酶能夠在大腸桿菌中表達(dá)。重組菌胞內(nèi)漆酶活力最高達(dá)到443.5U/L。2.S-CotA漆酶基因與乳酸菌表達(dá)載體pMG36... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)示意圖

乳酸乳球菌異源表達(dá)漆酶及在玉米秸稈青貯應(yīng)用V2代表在反應(yīng)體系中，酶液的體積。ε代表以ABTS為底物時，其產(chǎn)物在420nm處摩爾吸光系數(shù)36mM-1cm-1。d代表吸光杯的內(nèi)徑或光程厚度(cm)。n代表稀釋倍數(shù)。2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.3.1枯草芽孢桿菌CotA漆酶基因的PCR擴(kuò)增以pUC57-Simple-S-CotA質(zhì)粒DNA作為模板，PCR擴(kuò)增CotA漆酶基因，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳結(jié)果如圖2.2所示。擴(kuò)增得到的單一條帶大小約為1600bp，電泳結(jié)果與目的條帶（1563bp）大小相符，說明CotA漆酶基因克隆成功。圖2.2CotA漆酶基因PCR電泳圖M：Trans2000DNAMarker；1：CotA漆酶基因PCR產(chǎn)物Figure2.2PCRelectrophoresisofCotAlaccasegeneM:Trans2000DNAMarker;1:PCRproductofCotAlaccasegene2.3.2重組克隆載體的構(gòu)建及篩選鑒定2.3.2.1pEASY-Blunt-Simple-CotA重組質(zhì)粒PCR鑒定將pEASY-Blunt-Simple-CotA重組質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定，鑒定結(jié)果如圖2.3所示。擴(kuò)增得到的單一條帶大小約為1700bp，電泳結(jié)果與預(yù)期條帶（1665bp）大小相符（泳道5，8，10除外），初步證明重組克隆載體構(gòu)建成功。2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM119

內(nèi)蒙古大學(xué)圖2.3pEASY-Blunt-Simple-CotA質(zhì)粒PCR鑒定電泳圖M：Trans2000DNAMarker；1-4，6-7，9：陽性克隆PCR產(chǎn)物；5，8，10：陰性克隆PCR產(chǎn)物Figure2.3PlasmidPCRIdentificationElectrophoresisofpEASY-Blunt-Simple-CotAM:Trans2000DNAMarker;1-4,6-7,9:PCRproductsofpositiveclones;5,8,10:PCRproductsofnegativeclones2.3.2.2pEASY-Blunt-Simple-CotA重組質(zhì)粒單、雙酶切鑒定挑選PCR結(jié)果正確的重組質(zhì)粒進(jìn)一步進(jìn)行單、雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖2.4所示。單酶切獲得的條帶大于5000bp，雙酶切獲得了大小約為3800bp和1500bp的兩個條帶，單、雙酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符（重組質(zhì)粒與目的基因大小分別為5394bp和1549bp），證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。測序結(jié)果也表明目的序列沒有堿基突變（附錄10），可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。圖2.4pEASY-Blunt-Simple-CotA單、雙酶切產(chǎn)物驗(yàn)證電泳圖M：Trans5000DNAMarker；1-2：單酶切產(chǎn)物；3：雙酶切產(chǎn)物Figure2.4VerifyelectropherogramofsingleanddoubledigestedproductsofpEASY-Blunt-Simple-CotAM:Trans5000DNAMarker;1-2:singledigestedproduct;3:doubledigestedproduct2.3.3重組表達(dá)載體的構(gòu)建及篩選鑒定2.3.3.1pET-30a(+)及pEASY-Blunt-Simple-CotA的雙酶切根據(jù)pET-30a(+)及pEASY-Blunt-Simple-CotA上含有的NcoI及HindIII酶切位點(diǎn)，用2000bp1000bp500bp250bp100bp5000bp3000bp1500bp1000bp500bp300bpMM1234567891012320


本文編號：2897073