發(fā)布時(shí)間：2020-11-20 21:22

　　 磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的大量元素,在植物的生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用,磷缺乏將嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。由于作為磷肥主要來(lái)源的磷礦石資源的匱乏和趨于耗竭,缺磷已成為未來(lái)世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)調(diào)控磷效率相關(guān)基因的表達(dá),培育磷高效作物新品種,可有效地解決上述問題。選擇合適的啟動(dòng)子可以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因的有效表達(dá),有利于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成功應(yīng)用。因此,克隆可用于磷效率育種的啟動(dòng)子具有重要意義。ZmPht1;5編碼一個(gè)高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白,具有吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)磷的能力以及磷饑餓響應(yīng)特性,但其啟動(dòng)子序列一直未被克隆和研究,其潛在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不明確。本研究從玉米中克隆了 ZmPht1;5基因ATG上游的1895 bp序列(M2P-1),構(gòu)建了系列5’端缺失突變體(M2P-2～M2P-8),對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)的功能鑒定。M2P-1～M2P-8在煙草中的組織表達(dá)模式分析表明,其萌發(fā)2、7、14和21天的小苗,培養(yǎng)至60天及90天植株的根、莖、葉和生長(zhǎng)90天植株的種子、果實(shí)和花中均能驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá),但它們的表達(dá)活性存在明顯差異,其中M2P-7(-259 bp～-1 bp)的活性最高,在正常條件下可達(dá)到CaMV35S啟動(dòng)子的1.5倍左右,表明M2P-7片段可能是ZmPht1;5高強(qiáng)度表達(dá)的關(guān)鍵序列。為了明確啟動(dòng)子PZmPht1;5及其5’端缺失片段的磷饑餓響應(yīng)能力,我們以WT和CaMV35S轉(zhuǎn)基因煙草分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照,對(duì)15日齡的M2P-1～M2P-8突變體煙草及對(duì)照進(jìn)行了低磷脅迫(10μM KH2PO4)處理實(shí)驗(yàn)。GUS染色和酶活測(cè)定結(jié)果顯示,隨著植物體內(nèi)可溶性磷濃度的降低,M2P-1～M2P-8的啟動(dòng)子活性相應(yīng)增強(qiáng),而CaMV35S的啟動(dòng)子活性在低磷處理前后無(wú)顯著差異。值得注意的是在低磷處理至第9天時(shí),M2P-7在根、莖和葉中的啟動(dòng)子活性分別達(dá)到了CaMV35S啟動(dòng)子的3.5、4.0和3.3倍。以上結(jié)果表明,M2P-7可在低磷條件下驅(qū)動(dòng)目的基因高強(qiáng)度表達(dá),在雙子葉作物磷高效轉(zhuǎn)基因育種中具有重要應(yīng)用價(jià)值。為了進(jìn)一步評(píng)估M2P-7在單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用潛質(zhì),我們分別將M2P-7和玉米Ubi-1啟動(dòng)子(陽(yáng)性對(duì)照)連入pCAMBIA1391Z載體中,驅(qū)動(dòng)GUS的表達(dá),并導(dǎo)入玉米自交系Qi319中。GUS組織化學(xué)染色和酶活測(cè)定結(jié)果顯示,在萌發(fā)3天的種子胚根、7天和14天小苗的根、莖和葉中,M2P-7較Ubi-1似乎具有更高的啟動(dòng)子活性。為了明確M2P-7在玉米中是否依然具有磷饑餓響應(yīng)特性,我們對(duì)M2P-7和pCAMBIA1391Z-Ubi-GUS(陽(yáng)性對(duì)照)轉(zhuǎn)基因小苗進(jìn)行了低磷脅迫(5μM KH2PO4)處理實(shí)驗(yàn)。GUS組織化學(xué)染色和酶活測(cè)定結(jié)果顯示,在低磷處理至第7天和第10天時(shí)M2P-7在玉米根、莖和葉中的表達(dá)活性比足磷條件下提高了約1.3倍,而Ubi-1啟動(dòng)子在低磷處理前后無(wú)顯著差異。值得注意的是,盡管M2P-7在玉米中的磷饑餓誘導(dǎo)能力相對(duì)較低,但在低磷條件下M2P-7在所有檢測(cè)的組織中的啟動(dòng)子活性均顯著高于Ubi-1啟動(dòng)子,預(yù)示著M2P-7在單子葉植物磷高效育種中也具有很好的應(yīng)用潛質(zhì)�？傊�,本工作通過對(duì)ZmPht1;5啟動(dòng)子進(jìn)行5’系列缺失突變體的構(gòu)建、組織表達(dá)模式及磷饑餓響應(yīng)特性分析,發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)度為295-bp的M2P-7片段是該啟動(dòng)子的核心功能序列,具有高的啟動(dòng)子活性和一定的低磷誘導(dǎo)特性。在低磷脅迫條件下,M2P-7的啟動(dòng)子活性在煙草中可達(dá)到雙子葉植物轉(zhuǎn)化中最常用的CaMV35S啟動(dòng)子的3倍以上,在玉米中可達(dá)到單子葉作物育種中最常用的玉米Ubi-1啟動(dòng)子的大約1.3倍,在單子葉和雙子葉作物磷高效轉(zhuǎn)基因育種中均體現(xiàn)出了很高的應(yīng)用潛質(zhì)。上述研究結(jié)果不僅可加深我們對(duì)ZmPht1;5基因低磷脅迫響應(yīng)特性及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制的了解,而且為作物基因工程育種提供了可供選擇的啟動(dòng)子資源。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：S513
【部分圖文】：

?山東大學(xué)碩士學(xué)位論文???３．４?Ｍ２Ｐ－１－Ｍ２Ｐ－８轉(zhuǎn)基因本生煙草的獲得??將Ｍ２Ｐ－１?￣Ｍ２Ｐ－８質(zhì)粒以及驅(qū)動(dòng)Ｇｔ／Ｓ表達(dá)的質(zhì)粒（ｐＣＡＭＢＩＡ?１３０４Ｚ；??陽(yáng)性對(duì)照）利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)入本生煙草，轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)流程見圖??４。??ａ?ｂ?＇?ｃ??＃ｉ＞；??圖４農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉盤轉(zhuǎn)化流程??ａ，用于轉(zhuǎn)化的本生煙草；ｂ，農(nóng)桿菌侵染后避光共培養(yǎng)的葉盤；ｃ，在篩選培養(yǎng)基（含１５ｍｇ／Ｌ??潮霉素＋４００?ｍｇ／Ｌ頭孢）上篩選：ｄ，抗性愈傷分化生苗：ｅ，小苗移入Ａ５培養(yǎng)基生根；ｆ，??移栽至育苗土的小苗。??ＣＴＡＢ法提取轉(zhuǎn)化煙草植株的葉片基因組ＤＮＡ，利用引物ＧＵＳ－Ｆ／Ｒ?（表１）??進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增（圖５ａ）。ＰＣＲ陽(yáng)性的植株進(jìn)一步進(jìn)行ＧＵＳ染色鑒定（圖５ｂ），??兩者均為陽(yáng)性的植株用于收獲后代種子。通過潮霉素抗性篩選分離比為３：?１的??Ｔ１代轉(zhuǎn)基因株系再進(jìn)行后代繁殖（圖６）。最后，通過分離比統(tǒng)計(jì)選擇Ｔ３代單??拷貝純合轉(zhuǎn)基因品系用于后續(xù)功能分析。Ｍ２Ｐ－ＫＭ２Ｐ－８分別獲得了?４個(gè)以上來(lái)??自獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件的轉(zhuǎn)基因純合株系。因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)中來(lái)自同一個(gè)轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)的不同純??合株系間的ＧＯＳ表達(dá)水平差異并不明顯，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們?cè)诿總�(gè)轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)中??隨機(jī)性地挑選了?３個(gè)不同的純合子株系作為實(shí)驗(yàn)材料。??３１??

?山東大學(xué)碩士學(xué)位論文???Ｉｄ，泰??￥?方零？?＊｜＾ｐｒ??Ｎｅｇａｔｉｖｅ?Ｃｏｎｔｒｏｌ?（ＷＴ）?Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ?Ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ?Ｒａｔｉｏ?３：１?Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?Ｌｉｎｅ?Ｐｏｓｔｉｖｅ?Ｃｏｎｔｒｏｌ??圖６轉(zhuǎn)基因煙草Ｔ１代的單拷貝株系篩選??通過潮霉素抗性篩選分離比為３：?１的Ｔ１代轉(zhuǎn)基因株系。??３．５正常條件下５及其５’端缺失突變體在轉(zhuǎn)基因煙草中的??表達(dá)模式??為了明確正常條件下Ｍ２Ｐ－１？Ｍ２Ｐ－８及ＣａＭＦ３５＾啟動(dòng)子在煙草中的表達(dá)模??式，我們對(duì)萌發(fā)２、７、１４和２１天的轉(zhuǎn)基因煙草，生長(zhǎng)６０和９０天的植株的根、??莖和葉，以及生長(zhǎng)９０天植株的種子、花和果實(shí)進(jìn)行了?ＧＵＳ染色（圖７ａ）。ＧＵＳ??染色結(jié)果表明，Ｍ２Ｐ－ｌ￣Ｍ２Ｐ－８和啟動(dòng)子均可實(shí)現(xiàn)Ｇｔ／Ｓ在轉(zhuǎn)基因煙草??中表達(dá)，但它們?cè)冢牵眨尤旧珡?qiáng)度上存在較大差異。Ｍ２Ｐ－１?（全長(zhǎng)啟動(dòng)子）的ＧＵＳ??染色強(qiáng)度在所有供試組織中最弱，在萌發(fā)２、７、１４和２１天的轉(zhuǎn)基因幼苗的葉和??根中幾乎無(wú)法檢測(cè)到ＧＵＳ染色。值得注意的是，位于Ｍ２Ｐ－１－Ｍ２Ｐ－７之間的１６００??ｂｐ?（－１８９５—２９５?ｂｐ）片段的缺失導(dǎo)致Ｍ２Ｐ－７植株在各個(gè)組織的ＧＵＳ染色強(qiáng)度似??乎高于Ｍ２Ｐ－１？Ｍ２Ｐ－６、Ｍ２Ｐ－８和Ｑ７ＭＢ５Ｓ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因植株。為了進(jìn)一步評(píng)估??Ｍ２Ｐ１－Ｍ２Ｐ－８和啟動(dòng)子之間表達(dá)強(qiáng)度的差異，我們測(cè)定了生長(zhǎng)６０天??的轉(zhuǎn)基因煙草植株的根、莖和葉中的ＧＵＳ酶活（圖７ｂ）。結(jié)果顯示，隨著５’側(cè)??翼片段的不斷縮短，缺失突變體的啟動(dòng)子活性逐漸增加，在縮短到２９５ｂｐ（Ｍ２Ｐ－??７）時(shí)達(dá)到最高，然而在位于Ｍ２Ｐ－７？Ｍ

?山東大學(xué)碩士學(xué)位論文???果表明，磷饑餓抑制了轉(zhuǎn)基因煙草植株的生長(zhǎng)。??ａ?０?ｄ?３?ｄ?６ｄ?９?ｄ??ｎｒｉｍｔ?Ｊ??＇＾３?０．１５??Ｃ?〇．６１??〇．ｇ?－??ｍｍｍｍ?４?Ｐ?Ａ?＋?Ｐ?＋?Ｐ??Ｃ＝３?－?Ｐ?ｒ?ｆｔ?？?＝?－?Ｐ?？＝?＊?Ｐ??０．１２?ｒｈ?０５?！?＝〇６??ｉＥ』ｔ?Ｌ：：』ｌ??ｐ?ｊＦ?２??＾?０Ｊ？??ｚ??０＾７??－?０．４????—Ｐ?％?＋?Ｉ＊?Ｉ?＋?ｐ??－ｌｄ?６ｄ?９ｄ?３ｄ?６ｄ?９ｄ?３ｄ?６ｄ?９ｄ??圖８低磷處理對(duì)煙草植株磷濃度和生長(zhǎng)發(fā)育的影響??ａ，轉(zhuǎn)基因煙草植株的表型；ｂ－ｄ，根、地上部分和整個(gè)植株的生物量；ｅ，根冠比；ｆ－ｇ，根和??地上部分可溶性磷濃度。測(cè)定數(shù)據(jù)為３次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，每個(gè)株系３棵植株，＊代表??低磷處理前后的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)達(dá)到顯著差異水平（Ｐ＜０．０５，?ｆ檢驗(yàn)）。??為了明確５及其５’端缺失片段是否對(duì)磷饑餓有響應(yīng)，我們?cè)诘土??處理的第３、６和９天，通過ＧＵＳ組織化學(xué)染色和酶活定量分析，測(cè)定了?Ｍ２Ｐ－??１－Ｍ２Ｐ－８和啟動(dòng)子（陽(yáng)性對(duì)照）轉(zhuǎn)基因煙草幼苗的根、莖和葉中的ＧＵＳ??活性（圖９和圖１０）。結(jié)果顯示，隨著轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)可溶性磷濃度的降低，Ｍ２Ｐ－??ｌ￣Ｍ２Ｐ－８的啟動(dòng)子活性相應(yīng)增強(qiáng)。在低磷處理至第６天和第９天時(shí)，Ｍ２Ｐ－１？Ｍ２Ｐ－??８轉(zhuǎn)基因煙草的ＧＵＳ活性是足磷對(duì)照的２倍左右，而啟動(dòng)子在低磷處??理前后的ＧＵＳ活性無(wú)明顯差異（圖１０ｂ？ｃ）。值得注意的是，在缺磷條件下，Ｍ２Ｐ－??３６??
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本文編號(hào)：2892013