本文關(guān)鍵詞：致癌染料的生理毒性及分子機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院》 2015年

通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯斑馬魚(yú)hoxb4基因及其突變體基因型的初篩

袁夢(mèng)  

【摘要】：目的:造血干細(xì)胞是一群具有高度的自我復(fù)制及多項(xiàng)分化潛能的最原始的造血細(xì)胞。人類(lèi)HOXB4基因編碼一類(lèi)具有同源盒DNA依賴(lài)的結(jié)構(gòu)域核蛋白,在造血干細(xì)胞的自我更新和分化過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用。如何在體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞,使其既能保留其自我更新的特征又可以向不同血細(xì)胞分化是目前研究的重點(diǎn)和難點(diǎn),調(diào)控其增殖和分化的因素和機(jī)制尚不明了,本課題采用高效基因編輯系統(tǒng)CRISPR/Cas9在基因組水平對(duì)斑馬魚(yú)的hoxb4基因進(jìn)行編輯,并對(duì)其進(jìn)行陽(yáng)性突變體的篩選,以期建立下調(diào)hoxb4基因的突變體斑馬魚(yú)模型,為進(jìn)一步篩選其下游靶基因及探討對(duì)造血系統(tǒng)的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)材料及理論依據(jù)。方法:根據(jù)hoxb4基因的一號(hào)外顯子的正義鏈及反義鏈設(shè)計(jì)3個(gè)長(zhǎng)約20bp的g RNA,分別靶向Exon I的192#位點(diǎn),244#位點(diǎn)及313#位點(diǎn)�；瘜W(xué)合成g RNA(guide RNA)寡核苷酸序列,經(jīng)過(guò)酶切克隆連入p T7-g RNA質(zhì)粒中,構(gòu)建g RNA的體外轉(zhuǎn)錄載體并通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄得到靶位點(diǎn)的g RNA。將質(zhì)粒p SP6-2s NLS-sp Cas9線(xiàn)性化后經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄得到Cas9的m RNA并進(jìn)行添加A尾修飾,將以上靶位點(diǎn)的g RNA與Cas9的m RNA共注射入單細(xì)胞期的斑馬魚(yú)胚胎內(nèi),提取靶序列基因組DNA,PCR擴(kuò)增出靶序列并使用T7EI酶切測(cè)效,最后將PCR產(chǎn)物連入p MD19-T simple載體中,挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定,然后經(jīng)Sanger測(cè)序檢測(cè)突變類(lèi)型。結(jié)果:1.hoxb4靶序列基因組DNA的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序鑒定結(jié)果與預(yù)期相符;2.設(shè)計(jì)的敲除hoxb4靶點(diǎn)的g RNA寡核苷酸雙鏈成功連入p T7-g RNA質(zhì)粒中且經(jīng)堿基序列鑒定與預(yù)期相符;3.靶向hoxb4基因一號(hào)外顯子的313#位點(diǎn)的g RNA成功編輯斑馬魚(yú)hoxb4基因,經(jīng)T7EI酶切檢測(cè)其敲除效率高達(dá)26.5%;4.313#靶序列的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物成功連入p MD19-T simple載體中并經(jīng)測(cè)序篩選得到4種陽(yáng)性突變型;5.有30%的斑馬魚(yú)可看到心包增大、心腔壁變薄及血流減緩血細(xì)胞減少的表現(xiàn)。結(jié)論:1.作為同源盒基因的hoxb4基因其表達(dá)可能在一定程度上呈現(xiàn)功能冗余性,即一個(gè)基因的異常可以被另一個(gè)基因的功能來(lái)補(bǔ)償而不致引發(fā)疾病;2.通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功編輯斑馬魚(yú)hoxb4基因并測(cè)序鑒定其突變類(lèi)型,為HOXb4基因功能的研究提供可靠的基因敲除方法,為尋找其下游靶基因提供實(shí)驗(yàn)材料,為后期探討其機(jī)制并進(jìn)一步行體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞提供理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R457.7
【目錄】：

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