發(fā)布時間：2018-05-09 01:42

  本文選題：膀胱癌 + 微小RNA　； 參考：《浙江大學》2017年博士論文

【摘要】：背景:膀胱癌是危害人類健康的重要問題之一,在世界范圍內,膀胱癌的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中居于第九位,其中,在男性惡性腫瘤中位于第六位,在女性惡性腫瘤中位于第十位以后。我國膀胱癌的發(fā)病率與歐美國家相比相對較低,但隨著社會老齡化的加劇、人們生活方式的轉變以及新型分子標記物和影像學技術的應用,近年來我國膀胱癌的發(fā)病率及檢出率呈快速上升趨勢。最新數(shù)據(jù)顯示,我國男性膀胱癌發(fā)病率居于所有惡性腫瘤第七位,女性膀胱癌發(fā)病率則居于十五位以外。膀胱癌的腫瘤生物學行為復雜,具有易復發(fā)、易轉移等特點,數(shù)據(jù)表明,大約三分之一的初發(fā)膀胱癌會發(fā)生局部進展和遠處轉移,其5年生存期低于62%。遺傳學改變和環(huán)境改變在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用,但由于混雜因素眾多,如何研究并從中篩選出潛在方向,以闡明膀胱癌的致病機理,對于早期診斷和治療膀胱癌,提高患者生存期具有重要的臨床意義。microRNA(miRNA)是一類長度約為22個核苷酸長度的、內源性、非編碼的小RNA分子,這些miRNA通過與靶基因的3'非編碼區(qū)不完全互補配對以調控靶基因的表達。越來越多的研究表明miRNA異常表達與膀胱癌的進展和轉移有關。目的:在膀胱癌組織以及膀胱癌細胞株中利用原位雜交及熒光定量PCR法檢測miR-148a-3p的表達情況,并進一步探索miR-148a-3p表達下調的表觀遺傳學機制。采用獲得性功能實驗觀察miR-148a-3p在膀胱癌細胞系T24和UM-UC-3中的生物學功能。利用表達譜芯片、生物信息學預測和熒光素酶雙報告系統(tǒng)尋找并驗證miR-148a-3p的直接作用靶點,通過分析靶點基因的生物學功能,驗證miR-148a-3p對其調控機制及價值,并進一步探索及研究潛在的下游分子信號通路。方法:1)通過人膀胱癌組織芯片和microRNA探針原位雜交實驗,評估m(xù)iR-148a-3p在膀胱癌組織中的表達情況,并分析miR-148a-3p表達下調是否和啟動子區(qū)高甲基化有關;2)通過轉染miR-148a-3p模擬體(mimic)上調miR-148a-3p表達量來進行獲得性功能實驗。通過CCK-8、平板克隆形成、流式細胞周期檢測、裸鼠UM-UC-3細胞株皮下移植瘤模型和Transwell實驗等方法來探索上調miR-148a-3p的表達對于細胞增殖和遷移侵襲能力的影響;3)利用基因芯片和生物信息學在線預測網站對miR-148a-3p的直接作用的下游靶基因進行分析和預測,然后利用熒光定量PCR、Western Blot和免疫組化等實驗方法證實靶基因mRNA和蛋白水平表達的變化,并利用熒光素酶雙報告實驗對miR-148a-3p的靶基因進行驗證和鑒定,并進一步使用RNA干擾等實驗來明確靶向調控關系和下游機制。結果:1)我們發(fā)現(xiàn),癌組織和癌旁組織的miR-148a-3p表達量存在顯著差異(P0.0001),miR-148a-3p在膀胱癌組織中呈現(xiàn)低表達。同時,我們利用免疫組化評估DNMT1在膀胱癌組織中的表達情況,結果顯示,癌和癌旁組織中的DNMT1染色強度存在顯著的統(tǒng)計學差異,DNMT1在膀胱癌組織中呈現(xiàn)高表達(P0.0001)。膀胱癌中,miR-148a-3p啟動子區(qū)附近的CpG島呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài),這與miR-148a-3p在膀胱癌中的低表達密切相關。此外,DNMT1作為miR-148a-3p直接作用的靶基因,兩者之間在同一批膀胱癌組織中的表達量呈負相關(r = 0.108,P = 0.041)。因此我們認為,DNMT1和miR-148a-3p在膀胱癌中通過建立一個正反饋通路來調節(jié)miR-148a-3p在膀胱癌中的表達。2)我們發(fā)現(xiàn),上調miR-148a-3p的表達量能夠顯著抑制膀胱癌細胞的增殖、體外克隆形成、促進G1期周期阻滯,抑制遷移和侵襲能力。此外,上調miR-148a-3p的表達可抑制裸鼠UM-UC-3細胞株皮下移植瘤的生長。miR-148a-3p過表達可通過抑制AKT2/Snail通路來逆轉膀胱癌細胞中的EMT進程。這些結果提示我們miR-148a-3p可能在膀胱癌的進展中發(fā)揮著重要的抑癌作用。3)我們發(fā)現(xiàn)miR-148a-3p可以直接調控ERBB3基因的表達。此外,下調ERBB3的表達量能夠顯著抑制膀胱癌細胞的增殖、體外克隆形成、促進G1期周期阻滯,抑制遷移和侵襲能力。此外,Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)ERBB3蛋白的表達量和患者的OS具有顯著相關性(P=0.026)。我們進一步利用Cox比例風險回歸分析建立模型(包含年齡、性別、病理分級、臨床T分期、淋巴結轉移)來評估m(xù)iR-148a-3p,ERBB3和DNMT1表達量與OS的相關性,我們發(fā)現(xiàn),ERBB3與患者的OS顯著相關。同時,我們發(fā)現(xiàn)miR-148a-3p的表達與ERBB3的表達呈負相關(r=0.149,P =0.017),miR-148a-3p的表達與DNMT1 的表達呈負相關(r=0.108,P=0.041),DNMT1的表達與ERBB3的表達呈正相關(r=0.116,P=0.042)。這些結果提示我們ERBB3可能在膀胱癌的進展中發(fā)揮著重要作用。同時,我們發(fā)現(xiàn)miR-148a-3p可以通過靶向AKT2抑制膀胱癌細胞的增殖。4)我們發(fā)現(xiàn),miR-148a-3p 通過抑制 ERBB3/AKT2/c-myc 和ERBB3/AKT2/Snail兩條通路,抑制膀胱癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力。5)我們發(fā)現(xiàn),在過表達c-myc蛋白的時候,miR-148a-3p的表達量發(fā)生明顯下調,也就是說,miR-148a-3p/ERBB3/AKT2/c-myc通過建立正反饋調節(jié)通路調控膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。結論:1)miR-148a-3p在膀胱癌組織中呈現(xiàn)低表達,其原因可能在于DNMT1和miR-148a-3p通過在膀胱癌中·建立一個正反饋通路來調節(jié)miR-148a-3p在膀胱癌中的表達。2)上調miR-148a-3p的表達量能夠顯著抑制膀胱癌細胞的增殖、體外克隆形成、促進G1期周期阻滯,抑制遷移和侵襲能力。此外,miR-148a-3p過表達可通過抑制AKT2/Snail通路來逆轉膀胱癌細胞中的EMT進程。3)miR-148a-3p過表達可以顯著抑制其靶基因ERBB3和AKT2的mRNA和蛋白水平,通過抑制ERBB3/AKT2/c-myc和ERBB3/AKT2/Snail兩條通路,進一步抑制膀胱癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力。4)miR-148a-3p/ERBB3/AKT2/c-myc通過建立正反饋調節(jié)通路調控膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。
[Abstract]:Background : Bladder cancer is one of the most important problems in human health . In the world , the incidence of bladder cancer is located in the sixth place in all malignant tumors . The incidence of bladder cancer in China is less than 62 % . Results : 1 ) We found that there was a significant difference in the expression of miR - 148a - p in bladder cancer tissues ( P < 0.01 ) . We found that the expression of miR - 148a - 3P can significantly inhibit the proliferation of bladder cancer cells and inhibit the migration and invasion ability . These results suggest that ERBB3 may play an important role in the progression of bladder cancer . At the same time , we find that miR - 148a - 3P can inhibit the proliferation , invasion and migration of bladder cancer cells by targeting AKT2 .

【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.14

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本文編號：1864038