本文選題：HIF-1α + 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：背景:干細(xì)胞移植一直是諸多腦損傷疾病(包括腦卒中)治療應(yīng)用的研究熱點(diǎn),但其移植后的活力及其功能效率低下是干細(xì)胞治療效果不佳的主要原因之一。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia-Inducible-Factor-1-alpha,HIF-1α)是細(xì)胞處于低氧環(huán)境狀態(tài)下的一個(gè)較敏感分子。HIF-1α可以影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡,而關(guān)于HIF-1α對(duì)干細(xì)胞特別是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)移植治療腦卒中的療效影響及機(jī)制尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本課題通過(guò)在BMSCs細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HIF-1α,研究HIF-1α對(duì)BMSCs存活的影響以及是否可以提高BMSCs移植后的活力及其功能效率,探討影響B(tài)MSCs移植治療腦卒中療效的相關(guān)因素及相應(yīng)機(jī)制。方法:本研究分為體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。體外實(shí)驗(yàn)中,以CD29、CD90、CD105、CD45為主要標(biāo)志物,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)鑒定BMSCs;用HIF-1α綠色熒光蛋白(HIF-1α-green fluorescent protein,HIF-1α-GFP)慢病毒載體感染 BMSCs,并將 BMSCs 置于氧-糖剝奪(oxygen-glucose deprivation,OGD)條件下(37℃恒溫,以體積比50 mL C02/L+ 950 mL N2/L混合氣充氣30min,用于平衡pH值),無(wú)氧無(wú)糖培養(yǎng)BMSCs 2h;采用四甲基偶氮唑鹽比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法檢測(cè)BMSCs細(xì)胞存活率、流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況、電鏡檢測(cè)BMSCs細(xì)胞自噬的超微結(jié)構(gòu)、Western Blot檢測(cè)HIF-1α、凋亡和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá);使用腺苷酸活化蛋白激酶[Adenosine 5'-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK]的選擇性抑制劑即Compound C阻斷信號(hào)通路,檢測(cè)HIF-1α過(guò)表達(dá)是否通過(guò)激活A(yù)MPK、抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號(hào)通路而起到調(diào)控凋亡和自噬的作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,將HIF-1α過(guò)表達(dá)的BMSCs移植到大腦中動(dòng)脈閉塞模型(Middle Cerebralartery Occlusion,MCAO)大鼠左側(cè)紋狀體內(nèi),采用熒光顯微鏡觀察GFP陽(yáng)性細(xì)胞率,氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色法檢測(cè)大鼠顱腦梗死體積,改良大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分(modified neurological severity score,mNSS)評(píng)估 BMSCs 移植后的大鼠的神經(jīng)功能,Western Blot檢測(cè)BMSCs移植后相關(guān)細(xì)胞因子的變化。結(jié)果:體外實(shí)驗(yàn)中,流式細(xì)胞術(shù)鑒定BMSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)結(jié)果:其中 CD29(96.72%)、CD90(98.53%)、CD 105(98.99%)陽(yáng)性表達(dá);CD45(0.53%)陰性表達(dá)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示HIF-1α-GFP在BMSCs細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,與對(duì)照組相比,HIF-1α的mRNA和蛋白水平明顯升高。MTT、TUNEL和流式結(jié)果顯示:細(xì)胞在OGD條件下BMSCs存活率顯著降低,細(xì)胞凋亡明顯增加,而上調(diào)BMSCs細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)可以顯著增強(qiáng)BMSCs的細(xì)胞存活率,抑制細(xì)胞凋亡。在OGD誘導(dǎo)后凋亡蛋白Caspase-9、Bax的蛋白表達(dá)上調(diào),抗凋亡蛋白Bcl-2,Bcl-xl的蛋白表達(dá)下調(diào)。在OGD條件下,HIF-1α過(guò)表達(dá)可抑制Caspase-9和Bax的表達(dá),促進(jìn)Bcl-2,Bcl-xl的表達(dá)。電鏡檢測(cè)顯示:在OGD誘導(dǎo)后,在HIF-1α過(guò)表達(dá)的BMSCs細(xì)胞中觀察到較多的自噬體和自體溶酶體,并且HIF-1α過(guò)表達(dá)促進(jìn)了 LC3-II和Beclin1蛋白的表達(dá),抑制了 P62蛋白的表達(dá)。為進(jìn)一步探索HIF-1α調(diào)控BMSCs調(diào)控凋亡和自噬的機(jī)制,Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn):HIF-1α促進(jìn)了 OGD處理后細(xì)胞AMPK蛋白的磷酸化,并對(duì)mTOR磷酸化則產(chǎn)生抑制作用,而AMPK磷酸化抑制劑compound C逆轉(zhuǎn)了 HIF-1α對(duì)mTOR磷酸化的抑制作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,相較于正常的BMSCs移植組,HIF-1α過(guò)表達(dá)的BMSCs移植組GFP陽(yáng)性率升高,腦梗塞體積縮小更明顯,mNSS評(píng)分更佳,腫瘤壞死因子-a(tumor necrosis factor-a,TNF-α)、白介素 1β(interleukin 1β,IL1β)、IL-6炎性因子表達(dá)減少,腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)升高。結(jié)論:過(guò)表達(dá)HIF-1α可提高BMSCs移植后的細(xì)胞活力及其功能效率并提高BMSCs對(duì)腦卒中的療效。HIF-1α通過(guò)促進(jìn)BMSCs的AMPK蛋白磷酸化、抑制其mTOR磷酸化,抑制BMSCs的凋亡、促進(jìn)BMSCs的自噬,進(jìn)而使BMSCs存活率及功能效率增加,發(fā)揮療效作用。
[Abstract]:Background: stem cell transplantation has always been a hot spot in the treatment of many brain injury diseases (including stroke), but the vitality and low functional efficiency after transplantation are one of the main reasons for the poor effect of stem cell therapy. The hypoxia inducible factor -1 alpha (Hypoxia-Inducible-Factor-1-alpha, HIF-1 a) is in the condition of hypoxic environment. A more sensitive molecule.HIF-1 alpha can affect the proliferation and apoptosis of tumor cells, and the effect and mechanism of HIF-1 a for stem cells, especially bone marrow mesenchymal stem cells (Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) transplantation in the treatment of stroke, is rarely reported. This lesson is to study HIF-1 alpha by overexpressing HIF-1 a in BMSCs cells. The influence of the survival of BMSCs and whether it can improve the vitality and functional efficiency of BMSCs after transplantation, and discuss the related factors and mechanism affecting the therapeutic effect of BMSCs transplantation in the treatment of stroke. Methods: This study is divided into in vitro and in vivo experiments. In vitro, the main markers of CD29, CD90, CD105, CD45 are identified by flow cytometry. BMSCs, HIF-1 alpha green fluorescent protein (HIF-1 alpha -green fluorescent protein, HIF-1 alpha -GFP) infected BMSCs with lentivirus carrier, and BMSCs was placed under oxygen sugar deprivation (oxygen-glucose deprivation). The survival rate of BMSCs cells was detected by four methazazazoles colorimetric assay (methyl thiazolyl tetrazolium, MTT), flow cytometry and TUNEL assay were used to detect the apoptosis of cells. The ultrastructure of autophagy in BMSCs cells was detected by electron microscopy, Western Blot detected HIF-1 a, apoptosis and autophagic protein expression, and adenylate activated protein kinase [Adenos. Ine 5'-monophosphate (AMP) -activated protein kinase, a selective inhibitor of AMPK], the Compound C blocking signal pathway, detects whether the overexpression of HIF-1 alpha plays a role in the regulation of apoptosis and autophagy by activating AMPK and inhibiting the mammalian rapamycin target signaling pathway. Alpha overexpressed BMSCs was transplanted into the left striatum of Middle Cerebralartery Occlusion (MCAO) rats. The rate of GFP positive cells was observed by fluorescence microscopy, and the volume of cerebral infarction in rats was detected by three phenyl tetrazoles (triphenyl tetrazolium chloride, TTC), and the evaluation of neural function defect in rats was improved. Modified neurological severity score (mNSS) was used to evaluate the neural function of rats after BMSCs transplantation, and Western Blot detected the changes of related cytokines after BMSCs transplantation. Results: in the experiment, the expression results of BMSCs surface markers were identified by flow cytometry: CD29 (96.72%), CD90 (98.53%), and 105 (98.99%) positive expression; 0 .53%) negative expression.QRT-PCR detection results showed that HIF-1 alpha -GFP was transfected steadily in BMSCs cells. Compared with the control group, the mRNA and protein level of HIF-1 alpha was significantly increased.MTT. TUNEL and flow cytometry showed that the cell viability decreased significantly under OGD conditions, and cell apoptosis increased significantly. Increase the cell survival rate and inhibit apoptosis of BMSCs. After OGD induction, the apoptotic protein Caspase-9, Bax protein expression up-regulated, anti apoptotic protein Bcl-2, Bcl-xl protein expression down regulated. Under OGD conditions, the overexpression of HIF-1 a can inhibit the expression of Caspase-9 and Bax, and promote Bcl-2, Bcl-xl expression. More autophagosomes and autophagosomes were observed in 1 alpha overexpressed BMSCs cells, and the overexpression of HIF-1 a promoted the expression of LC3-II and Beclin1 protein and inhibited the expression of P62 protein. To further explore the mechanism of HIF-1 a to regulate the regulation of apoptosis and autophagy by BMSCs, Western Blot detected that HIF-1 a promoted cell AMPK after OGD treatment. Phosphorylation of protein could inhibit the phosphorylation of mTOR, and AMPK phosphorylation inhibitor compound C reversed the inhibition of HIF-1 alpha to mTOR phosphorylation. In vivo, the GFP positive rate of HIF-1 a over expressed BMSCs transplantation group was higher than that of the normal BMSCs transplantation group. The volume of cerebral infarction narrowed more significantly, the mNSS score was better, tumor was better, tumor was better, tumor was better, tumor was better, tumor was better, tumor was better. Necrosis factor -a (tumor necrosis factor-A, TNF- a), interleukin 1 beta (interleukin 1 beta, IL1 beta), IL-6 inflammatory factor expression decreased, brain derived neurotrophic factor (brain-derived neurotrophic factor, BDNF), vascular endothelial growth factor (VEGF) and other nutritional factors increased. Conclusion: overexpression of alpha alpha It can improve the cell viability and functional efficiency of BMSCs after transplantation and improve the therapeutic effect of BMSCs on stroke..HIF-1 alpha can promote the phosphorylation of AMPK protein of BMSCs, inhibit the phosphorylation of mTOR, inhibit the apoptosis of BMSCs and promote the autophagy of BMSCs, and then increase the survival rate and functional efficiency of BMSCs, and play an effective role.

【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R743.3

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