本文選題：人參皂苷Rb2 + 人參皂苷Rg2�。� 參考：《吉林大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：本研究運用細(xì)胞模型(體外培養(yǎng)H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷模型)和動物模型(在體大鼠心肌缺血再灌注損傷動物模型),觀察人參皂苷Rb2和Rg2預(yù)處理對心肌細(xì)胞氧化性損傷和心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其分子機制。主要研究如下:一、基于SIRT1信號通路的人參皂苷Rb2預(yù)處理對心肌損傷的保護作用及機制研究1.人參皂苷Rb2預(yù)處理對H2O2損傷H9c2心肌細(xì)胞的保護作用研究方法:采用人參皂苷Rb2(1、3、10μg/mL)預(yù)處理4 h,再加入H202150 μM作用6 h,觀察人參皂苷Rb2對H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響。應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞存活率;熒光倒置顯微鏡觀察心肌細(xì)胞生長狀態(tài)和DAPI染色后細(xì)胞形態(tài);分光光度法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶(LDH)活性,心肌細(xì)胞的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性和丙二醛(MDA)含量;流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的水平;Annexin V/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡情況;蛋白免疫印記(Western Blot)檢測心肌細(xì)胞Procaspase-3、Procaspase-9、Bcl-2、Bax 和 SIRT1 蛋白表達(dá)情況。研究結(jié)果:H9c2心肌細(xì)胞經(jīng)人參皂昔Rb2(1、3、10μg/mL)預(yù)處理4h,再加入H2O2 150 μM作用6h,與Model組比較,人參皂苷Rb2(1、3、10μg/mL)預(yù)處理均可提高心肌細(xì)胞存活率(P0.01);人參皂苷Rb2(1、3、10μg/mL)預(yù)處理后均能不同程度減輕H202誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷,可使心肌細(xì)胞偽足回縮減輕,空泡數(shù)量減少,懸浮細(xì)胞明顯減少;人參皂苷Rb2預(yù)處理可明顯降低H2O2損傷H9c2心肌細(xì)胞LDH漏出率,降低MDA含量,升高SOD、GSH-PX活性,減少ROS的產(chǎn)生(P0.05或P0.01),提示其能明顯增強H9c2心肌細(xì)胞的抗氧化能力;經(jīng)DAPI染色后熒光倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rb2預(yù)處理后能明顯減少凋亡細(xì)胞數(shù)量,且呈劑量依賴關(guān)系;AnnexinV/PI染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測,人參皂苷Rb2(1、3、10 μg/mL)預(yù)處理后均能明顯降低心肌細(xì)胞凋亡率(P0.01);Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb2(1、3、10 μg/mL)預(yù)處理后抑制心肌細(xì)胞Procaspase-3和Procaspase-9的剪切活化,上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá),下調(diào)Bax蛋白表達(dá),并且Bcl-2/Bax的比例也隨藥物濃度的增加而升高;Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb2(1、3、10μg/mL)預(yù)處理后可使心肌細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)明顯增多(P0.01)。2.人參皂苷Rb2預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用研究方法:將Wistar大鼠隨機分為Sham組、MI/R組、人參皂苷Rb2(10、20mg/kg)劑量組和Diltiazem組。結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支,缺血30min,再灌注6 h,每組取部分大鼠檢測心肌梗死面積、血液生化學(xué)、心肌細(xì)胞凋亡、組織病理學(xué)等相關(guān)指標(biāo),剩余大鼠再灌注72 h,評價心臟功能,觀察人參皂苷Rb2預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響。應(yīng)用彩色多普勒超聲便攜機檢測大鼠心臟功能;測定心肌梗死面積;利用自動生化分析儀測定血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)及LDH活性;分光光度法檢測心肌組織中SOD、GSH-PX、過氧化氫酶(CAT)活性和MDA含量;QPCR檢測心肌組織中促炎性細(xì)胞因子相關(guān)基因表達(dá)水平;觀察心肌組織HE染色及電鏡超微結(jié)構(gòu);TUNEL法檢測心肌組織凋亡;免疫組織化學(xué)方法檢測大鼠心肌組織中 SIRT1 蛋白表達(dá)水平;Western Blot 檢測心肌組織 Procaspase-3、Procaspase-9、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá),檢測心肌組織SIRTl/p53、PI3K/Akt通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)及其磷酸化水平。研究結(jié)果:人參皂昔Rb2 10、20 mg/kg均能使MI/R大鼠LVIDd、LVIDs減少,同時增加LVEF、LVFS,說明人參皂苷Rb2預(yù)處理可明顯改善心肌缺血再灌注損傷大鼠的心功能;與MI/R組比較,人參皂苷Rb2 10、20mg/kg均可明顯減小大鼠MIS(P0.05或P0.01),降低大鼠血清中CK-MB、AST和LDH活性(P0.05或P0.01),并能降低心肌組織中MD A含量,升高SOD、CAT和GSH-PX活性(P0.01),降低心肌組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平(P0.05或P0.01),減輕MI/R大鼠心肌組織的病理學(xué)損傷改變,明顯降低心肌缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(P0.01)。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rb2抑制Procaspase-3和Procaspase-9的剪切活化,上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平,下調(diào)Bax蛋白表達(dá)水平;人參皂苷Rb2預(yù)處理可明顯上調(diào)MI/R大鼠心肌組織SIRT1的蛋白表達(dá),下調(diào)A-p53的蛋白表達(dá),提示其抗心肌缺血再灌注損傷作用與激活SIRT1和使p53去乙�；嘘P(guān);人參皂苷Rb2可明顯上調(diào)MI/R大鼠心肌組織中PI3K、Akt和eNOS的磷酸化水平,提示其抗心肌缺血再灌注損傷作用與激活PI3K/Akt/eNOS信號通路有關(guān)。3.基于SIRT1信號通路的人參皂苷Rb2預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護作用及機制研究研究方法:將Wistar大鼠隨機分為MI/R組、MI/R+Rb2組、MI/R+Rb2+EX527(SIRT1信號通路抑制劑)組和MI/R+EX527組,給予相應(yīng)藥物后制備MI/R模型。結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支,缺血30 min,再灌注6 h,每組取部分大鼠檢測心肌梗死面積、血液生化學(xué)、心肌細(xì)胞凋亡、組織病理學(xué)等相關(guān)指標(biāo),剩余大鼠再灌注72 h,評價心臟功能。應(yīng)用彩色多普勒超聲便攜機檢測大鼠心臟功能;測定心肌梗死面積;利用自動生化分析儀測定血清心肌三酶活性;分光光度法檢測心肌組織中SOD、GSH-PX、CAT活性和MDA含量;QPCR檢測心肌組織中促炎性細(xì)胞因子相關(guān)基因表達(dá)水平;觀察心肌組織HE染色及電鏡超微結(jié)構(gòu);TUNEL法檢測心肌組織凋亡;免疫組織化學(xué)方法檢測大鼠心肌組織中SIRT1蛋白表達(dá)水平;Western Blot 檢測心肌組織 Procaspase-3、Procaspase-9、Bax 和 Bcl-2蛋白表達(dá),檢測心肌組織SIRT1/p53、PI3K/Akt通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)及其磷酸化水平。研究結(jié)果:人參皂苷Rb2預(yù)處理可明顯改善MI/R大鼠心功能,減小心肌梗死面積,降低血清心肌三酶活性,改善心肌組織損傷的病理學(xué)變化,而EX527可以拮抗人參皂苷Rb2的作用;人參皂昔Rb2預(yù)處理可明顯增加大鼠心肌組織SOD、CAT和GSH-PX活性,降低MDA含量,而EX527可以拮抗人參皂苷Rb2的抗氧化應(yīng)激損傷作用;人參皂苷Rb2可明顯降低心肌組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平,抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生,而EX527可以拮抗人參皂苷Rb2的作用;人參皂苷Rb2預(yù)處理可明顯降低MI/R大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù),抑制Procaspase-3和Procaspase-9的剪切活化,上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平,下調(diào)Bax蛋白表達(dá)水平,而EX527可以拮抗人參皂苷Rb2的作用;人參皂苷Rb2預(yù)處理可明顯上調(diào)MI/R大鼠心肌組織SIRT1的蛋白表達(dá),下調(diào)A-p53的蛋白表達(dá),而EX527可以拮抗人參皂苷Rb2的作用;人參皂苷Rb2可明顯上調(diào)MI/R大鼠心肌組織中PI3K、Akt和eNOS的磷酸化水平,而EX527可以拮抗人參皂苷Rb2的作用。二、基于SIRT1信號通路的人參皂苷Rg2預(yù)處理對心肌損傷的保護作用及機制研究1.人參皂苷Rg2預(yù)處理對H2O2損傷H9c2心肌細(xì)胞的保護作用研究方法:采用人參皂苷Rg2(1、3、10μg/mL)預(yù)處理4h,再加入H202150μM作用6 h,觀察人參皂苷Rg2對H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響。應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞存活率;熒光倒置顯微鏡觀察心肌細(xì)胞生長狀態(tài)和DAPI染色后細(xì)胞形態(tài);分光光度法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH活性,測定心肌細(xì)胞SOD、GSH-PX活性和MDA含量;流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平;AnnexinV/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡情況;Western Blot 檢測心肌細(xì)胞 Procaspase-3、Procaspase-9、Bcl-2、Bax和SIRT1蛋白表達(dá)情況。研究結(jié)果:H9c2心肌細(xì)胞經(jīng)人參皂苷Rg2(1、3、10μμg/mL)預(yù)處理4h,再加入H2O2150 μ作用6 h,與Model組比較,人參皂苷Rg2(1、3、10μg/mL)預(yù)處理可提高心肌細(xì)胞存活率(P0.01);人參皂苷Rg2(1、3、10μg/mL)預(yù)處理后均能不同程度減輕H2O2所致的H9c2細(xì)胞損傷,可使心肌細(xì)胞偽足回縮減輕,空泡數(shù)量減少,懸浮細(xì)胞明顯減少;人參皂苷Rg2預(yù)處理可明顯降低H2O2損傷H9c2心肌細(xì)胞LDH漏出率,降低MDA含量,升高SOD和GSH-PX活性,減少ROS的產(chǎn)生(P0.05或P0.01),提示其能明顯增強H9c2心肌細(xì)胞的抗氧化能力;經(jīng)DAPI染色后熒光倒置顯微鏡觀察,人參皂苷Rg2預(yù)處理后能明顯減少凋亡細(xì)胞數(shù)量,且呈劑量依賴關(guān)系;AnnexinV/PI染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測,人參皂苷Rg2預(yù)處理后均能明顯降低心肌細(xì)胞凋亡率;Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)人參阜苷 Rg2(1、3、10 μg/mL)預(yù)處理可抑制 Procaspase-3 和 Procaspase-9 的剪切活化,上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá),下調(diào)Bax蛋白表達(dá),并且Bcl-2/Bax的比例也隨藥物濃度的增加而升高;Western Blot檢測發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rg2(1、3、10 μg/mL)預(yù)處理后可使心肌細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)明顯增多(P0.01)。2.人參皂苷Rg2預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用研究方法:將Wistar大鼠隨機分為Sham組、MI/R組、人參皂苷Rg2(10、20mg/kg)劑量組和Diltiazem組。結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支,缺血30min,再灌注6 h,每組取部分大鼠檢測心肌梗死面積、血液生化學(xué)、心肌細(xì)胞凋亡、組織病理學(xué)等相關(guān)指標(biāo),剩余大鼠再灌注72 h,評價心臟功能,觀察人參皂苷Rg2對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響。應(yīng)用彩色多普勒超聲便攜機檢測心臟功能;測定心肌梗死面積;利用自動生化分析儀測定CK-MB、AST及LDH活性;分光光度法檢測心肌組織中SOD、GSH-PX、CAT活性和MDA含量;QPCR檢測心肌組織中促炎性細(xì)胞因子相關(guān)基因表達(dá)水平;觀察心肌組織HE染色及電鏡超微結(jié)構(gòu);TUNEL法檢測心肌組織凋亡;免疫組織化學(xué)方法檢測大鼠心肌組織中 SIRT1 蛋白表達(dá)水平;Western Blot 檢測心肌組織 Procaspase-3、Procaspase-9、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá),檢測心肌組織SIRT1/p53、PI3K/Akt通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)及其磷酸化水平。研究結(jié)果:人參皂苷Rg2 10、20 mg/kg均能使MI/R大鼠LVIDd、LVIDs減少,同時增加LVEF、LVFS,說明人參皂苷Rg2預(yù)處理可明顯改善MI/R大鼠的心功能;與MI/R組比較,人參皂苷Rg2 10、20mg/kg均可明顯減小大鼠MIS(P0.05或P0.01),降低大鼠血清中CK-MB、AST和LDH活性(P0.05或P0.01),降低心肌組織中MDA含量,升高SOD、CAT和GSH-PX活性(P0.01),降低心肌組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平(P0.05或P0.01),減輕MI/R大鼠心肌組織的病理學(xué)損傷改變,明顯降低心肌缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(P0.01)。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn),人參皂昔Rg2可制Procaspase-3和Procaspase-9的剪切活化,上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平,下調(diào)Bax蛋白表達(dá)水平;人參皂苷Rg2預(yù)處理可明顯上調(diào)MI/R大鼠心肌組織SIRT1的蛋白表達(dá),下調(diào)A-p53的蛋白表達(dá),提示其抗心肌缺血再灌注損傷作用與激活SIRT1和使p53去乙�；嘘P(guān);人參皂苷Rg2可明顯上調(diào)MI/R大鼠心肌組織中PI3K、Akt和eNOS蛋白的磷酸化水平,提示其抗心肌缺血再灌注損傷作用與激活PI3K/Akt/eNOS信號通路有關(guān)。3.基于SIRT1信號通路的人參皂苷Rg2對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護作用及機制研究研究方法:將Wistar大鼠隨機分為MI/R組、MI/R+Rg2組、MI/R+Rg2+EX527組和MI/R+EX527組。結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支,缺血30min,再灌注6h,每組取部分大鼠檢測心肌梗死面積、血液生化學(xué)、心肌細(xì)胞凋亡和組織病理學(xué)等相關(guān)指標(biāo),剩余大鼠再灌注72h,評價心臟功能。檢測大鼠心臟功能;測定心肌梗死面積;利用自動生化分析儀測定血清心肌三酶活性;分光光度法檢測心肌組織中SOD、GSH-PX、CAT活性和MDA含量;QPCR檢測心肌組織中促炎性細(xì)胞因子相關(guān)基因表達(dá)水平;觀察心肌組織HE染色及電鏡超微結(jié)構(gòu);TUNEL法檢測心肌組織凋亡;免疫組織化學(xué)方法檢測大鼠心肌組織中SIRT1蛋白表達(dá)水平;Western Blot 檢測心肌組織 Procaspase-3、Procaspase-9、Bax 和 Bcl-2 蛋白表達(dá),檢測心肌組織SIRT1/p53、PI3K/Akt通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)及其磷酸化水平。研究結(jié)果:人參皂苷Rg2預(yù)處理可明顯改善MI/R大鼠心功能,減小心肌梗死面積,降低血清心肌三酶活性,改善心肌組織損傷的病理學(xué)變化,而EX527可以拮抗人參皂苷Rg2的作用;人參皂苷Rg2預(yù)處理可明顯增加大鼠心肌組織SOD、CAT和GSH-PX活性,降低MDA含量,而EX527可以拮抗人參皂苷Rg2的抗氧化應(yīng)激損傷作用;人參皂苷Rg2可明顯降低心肌組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平,抑制炎癥反應(yīng),而EX527可以拮抗人參皂苷Rg2的作用;人參皂苷Rg2預(yù)處理可明顯降低MI/R大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù),抑制Procaspase-3和Procaspase-9的剪切活化,上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平,下調(diào)Bax蛋白表達(dá)水平,而EX527可以拮抗人參皂苷Rg2的作用;人參皂苷Rg2預(yù)處理可明顯上調(diào)MI/R大鼠心肌組織SIRT1的蛋白表達(dá),下調(diào)A-p53的蛋白表達(dá),而EX527可以拮抗人參皂苷Rb2的作用;人參皂苷Rb2可明顯上調(diào)MI/R大鼠心肌組織中PI3K、Akt和eNOS蛋白的磷酸化水平,而EX527可以拮抗人參皂昔Rg2的作用。本研究從細(xì)胞水平和整體動物水平上,證實了人參皂苷Rb2和Rg2預(yù)處理對H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷和心肌缺血再灌注損傷均具有保護作用,并初步闡述了其作用機制。人參皂苷Rb2和Rg2預(yù)處理均通過激活SIRT1,活化PI3K/Akt信號通路,對大鼠心肌缺血再灌注損傷起保護作用。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
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本文編號：1819157