ADAMTS5在肝細胞性肝癌中的表達及其作用機制的研究
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《第三軍醫(yī)大學(xué)》 2015年
ADAMTS5在肝細胞性肝癌中的表達及其作用機制的研究
李崇義
【摘要】:背景肝細胞性肝癌(HCC)是肝臟最常見的原發(fā)惡性腫瘤,具有較高的發(fā)病率和致死率。由于其容易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的特點,HCC患者常表現(xiàn)為預(yù)后不良。因此,我們需要進一步研究肝細胞性肝癌的分子生物學(xué)機制,為其診斷和治療提供新的策略。含I型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶5(ADAMTS5),與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和解聚蛋白樣金屬蛋白酶(ADAM)同屬Zn2+依賴的金屬蛋白酶家族。其異常表達在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。關(guān)于其蛋白結(jié)構(gòu)的研究顯示,ADAMTS5除具有蛋白聚糖酶的活性外,更具有抗血管生成的作用。因此研究ADAMTS5在HCC中的表達及其作用機制具有重要意義。rs2830585是位于編碼ADAMTS5的TSP重復(fù)序列1(TSR1)結(jié)構(gòu)域的基因序列中的非同義單核苷酸多態(tài)性位點(nsSNP),SNPs3D軟件預(yù)測結(jié)果顯示rs2830585可通過改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列從而影響ADAMTS5的功能,而TSR1結(jié)構(gòu)域是ADAMTS5發(fā)揮抗血管生成活性的關(guān)鍵。因此,對于以豐富腫瘤血管生成為重要特征的的肝細胞性肝癌,研究ADAMTS5 rs2830585單核苷酸多態(tài)性與肝細胞性肝癌腫瘤易感性之間的關(guān)系具有重要意義。目的1、檢測ADAMTS5在肝細胞性肝癌中的表達情況及其與臨床病理因素之間的關(guān)系。2、闡明ADAMTS5在肝細胞性肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制。3、明確ADAMTS5 rs2830585單核苷酸多態(tài)性與肝細胞性肝癌腫瘤易感性之間的關(guān)系。方法第一部分ADAMTS5在肝細胞性肝癌中的表達及其意義1、采用肝細胞性肝癌組織芯片及免疫組化,檢測肝細胞性肝癌組織中ADAMTS5、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、CD34的表達。2、采用McNemar檢驗比較ADAMTS5在肝細胞性肝癌癌組織及癌周正常組織的表達差異。3、采用卡方檢驗或fisher精確概率檢驗比較adamts5的表達與臨床病理因素之間的相關(guān)性。4、采用spearman等級相關(guān)系數(shù)比較adamts5、vegf、微血管密度(mvd)和腫瘤體積的相關(guān)性。5、采用生存分析比較adamts5的表達與患者總生存時間的關(guān)系。6、采用westernblot檢測adamts5在正常肝細胞系與不同hcc細胞系中的表達。第二部分adamts5在血管形成中的作用及其機制1、通過構(gòu)建高表達adamts5的肝細胞性肝癌細胞系及酶聯(lián)免疫吸附測定法(elisa),確定肝細胞性肝癌中adamts5的表達對vegf分泌的影響。2、通過huvec細胞遷移和管狀形成實驗,檢測肝細胞性肝癌細胞條件培養(yǎng)基對huvec細胞遷移和管狀形成的影響。3、通過移植物成瘤實驗,進一步在體內(nèi)確定adamts5對肝細胞性肝癌腫瘤生長及血管生成的影響。第三部分adamts5單核苷酸多態(tài)性與中國漢族人群肝細胞癌易感性的研究1、收集220例肝細胞性肝癌患者和220例非肝細胞性肝癌對照患者臨床資料,并進行隨訪。2、經(jīng)知情同意,提取患者外周血dna,針對rs2830585單核苷酸多態(tài)性位點進行進行基因測序。3、使用spss19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果第一部分adamts5在肝細胞性肝癌中的表達及其意義1、adamts5在肝細胞性肝癌癌組織中的表達顯著低于癌周正常肝組織(mcnemar檢驗,p0.05)2、adamts5的表達與腫瘤分期顯著相關(guān)(p0.01)。3、肝細胞性肝癌組織中adamts5的表達與mvd(r=-0.530,p0.001)、vegf(r=-0.640,p0.001)及腫瘤體積(r=-0.361,p0.05)顯著負相關(guān)。4、adamts5陽性表達肝細胞性肝癌患者總生存時間顯著優(yōu)于陰性表達adamts5患者(29.56versus12.96,p0.001),adamts5可作為獨立的預(yù)后因子預(yù)測肝細胞性肝癌患者的總生存時間(p0.05)。5、ADAMTS5在正常肝細胞系L02中的表達高于肝細胞性肝癌細胞系。第二部分ADAMTS5在血管形成中的作用及其機制1、高表達ADAMTS5肝細胞性肝癌細胞條件培養(yǎng)基中VEGF的表達顯著低于其對照組細胞條件培養(yǎng)基(p0.001)。2、與對照組細胞條件培養(yǎng)基相比較,高表達ADAMTS5肝細胞性肝癌細胞條件培養(yǎng)基可顯著抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)遷移和管狀形成能力(p0.01),并且人重組VEGF可以從很大程度上恢復(fù)HUVEC細胞被抑制的遷移和管狀形成能力(p0.01)。3、高表達ADAMTS5肝細胞性肝癌細胞裸鼠移植瘤生長受到顯著抑制(p0.01),免疫組化結(jié)果顯示ADAMTS5在裸鼠移植瘤中的高表達抑制了腫瘤內(nèi)的血管形成和VEGF表達。第三部分ADAMTS5單核苷酸多態(tài)性與中國漢族人群肝細胞癌易感性的研究1、Logistic回歸分析結(jié)果顯示,與rs2830585 G等位基因相比,A等位基因顯著降低肝細胞性肝癌發(fā)生風(fēng)險(adjusted OR,0.348;95%CI 0.236-0.512;P0.001);攜帶rs2830585 GA基因型的個體發(fā)生肝細胞性肝癌風(fēng)險顯著低于GG基因型攜帶者(adjusted OR,0.339;95%CI,0.044-11.535;P0.001)。2、分層分析結(jié)果顯示,rs2830585基因型與分層因素之間不存在顯著交互作用。3、相關(guān)性分析結(jié)果顯示,rs2830585基因型與肝細胞性肝癌臨床病理因素間不存在顯著相關(guān)性。結(jié)論1、ADAMTS5在肝細胞性肝癌中表達下調(diào),其高表達與肝細胞性肝癌患者的良好預(yù)后相關(guān)。2、ADAMTS5通過減少肝細胞性肝癌中VEGF的分泌,抑制腫瘤血管生成及生長。3、ADAMTS5 rs2830585與肝細胞性肝癌的易感性顯著相關(guān),其突變型等位基因A顯著降低肝細胞性肝癌的發(fā)病風(fēng)險。
【關(guān)鍵詞】:
【學(xué)位授予單位】:第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2015
【分類號】:R735.7
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