發(fā)布時(shí)間：2018-01-16 03:28

  本文關(guān)鍵詞：乙型肝炎病毒蛋白對(duì)肝細(xì)胞炎性反應(yīng)及調(diào)控機(jī)制研究　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：天然免疫反應(yīng)系統(tǒng)在抵抗乙型肝炎病毒(HBV)感染中發(fā)揮重要作用。作為肝臟最主要的組成,肝細(xì)胞在肝臟免疫調(diào)控中可能發(fā)揮了主導(dǎo)作用。本課題研究了 HBV蛋白表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞/肝癌細(xì)胞炎性反應(yīng)的調(diào)控及其作用機(jī)制,為闡明HBV蛋白與肝細(xì)胞在肝臟疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用提供了研究基礎(chǔ)。研究方法1、構(gòu)建HBV蛋白表達(dá)重組載體,轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞/肝癌細(xì)胞。通過(guò)熒光PCR研究肝細(xì)胞/肝癌細(xì)胞內(nèi)炎性效應(yīng)分子在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)變化趨勢(shì),利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot)來(lái)研究炎性效應(yīng)分子在蛋白水平的表達(dá)變化情況;2、利用Western Blot和免疫熒光試驗(yàn),借助特異的信號(hào)通路抑制劑,研究HBV蛋白引起的炎性效應(yīng)中涉及到的信號(hào)通路及其作用;3、構(gòu)建HBV核心抗原(HBc)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,檢測(cè)HBc在細(xì)胞增殖中的作用;4、轉(zhuǎn)染siRNA研究肝癌細(xì)胞內(nèi)HMGB1在HBc促細(xì)胞增殖過(guò)程中的作用,結(jié)合Western Blot技術(shù),研究涉及到的信號(hào)通路。研究結(jié)果1、HBV 大蛋白(LHBs)和 HBc 能夠上調(diào) AIM2、IL-1β、IL-18、IL-6和TN αmRNA等炎性基因的表達(dá);中蛋白(MHBs)能夠上調(diào)AIM2、IL-6和TNFα mRNA的表達(dá);小蛋白(SHBs)除引起TNFα表達(dá)量上調(diào)外,對(duì)其它基因的表達(dá)無(wú)影響。在SMMC-7721、L-02和Huh7細(xì)胞中,LHBs、HBc和MHBs組IL-6表達(dá)量上調(diào)且在24小時(shí)達(dá)到高值。在HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中,MHBs和HBc組TNFα表達(dá)量在轉(zhuǎn)染6小時(shí)時(shí)達(dá)到高值,隨后下降,在Huh7和L-02細(xì)胞中,變化趨勢(shì)與此相反。在Huh7細(xì)胞中,MHBs上調(diào)HMGB1的表達(dá),且在24小時(shí)達(dá)到高值,在L-02和SMMC-7721細(xì)胞中,隨時(shí)間延長(zhǎng),MHBs組HMGB1的表達(dá)量逐漸下降;2、MHBs激活MAPKp38/NF-KB以促進(jìn)IL-6的表達(dá)和分泌,這種效應(yīng)依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力;在Huh7細(xì)胞中,MHBs活化NF-κB來(lái)上調(diào)HMGB1的表達(dá),且引起HMGB1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到胞質(zhì);3、HBc通過(guò)激活MAPK p38、ERK1/2和NF-κB來(lái)促進(jìn)IL-6的表達(dá)和分泌,但此效應(yīng)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力無(wú)關(guān);在Huh7細(xì)胞中,HBc激活NF-κB以促進(jìn)HMGB1的表達(dá),但不會(huì)引起HMGB1從細(xì)胞核到胞質(zhì)的移位;HBc促進(jìn)Huh7細(xì)胞的增殖,HMGB1 siRNA抑制HBc的促增殖作用,同時(shí)也抑制HBc對(duì)ERK1/2的激活,但對(duì)MAPKp38信號(hào)通路無(wú)影響。研究結(jié)論1、同一 HBV蛋白在不同細(xì)胞株中引起的效應(yīng)不一致,同一細(xì)胞株對(duì)不同HBV蛋白的反應(yīng)也不同�？傮w來(lái)說(shuō),LHBs、MHBs和HBc會(huì)引起炎性基因表達(dá)的變化;除TNFα外,SHBs對(duì)肝細(xì)胞/肝癌細(xì)胞內(nèi)其它炎性基因的表達(dá)無(wú)顯著影響;2、MHBs誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力,激活p38/NF-κB通路,上調(diào)IL-6的表達(dá)與分泌,增強(qiáng)HMGB1的表達(dá),并導(dǎo)致其從核轉(zhuǎn)移到胞質(zhì),表明,MHBs主要作為肝細(xì)胞/肝癌細(xì)胞的壓力性刺激因子起作用;3、HBc 激活 MAPK p38、ERK1/2 和 NF-κB,上調(diào) IL-6 和 HMGB1 的表達(dá),促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖,表明,HBc作為促炎因子和促增殖因子,具有多重作用。
[Abstract]:Innate immune response system plays an important role in resisting hepatitis B virus (HBV) infection and is the most important component of liver. Hepatocytes may play a leading role in the regulation of liver immunity. In this study, we studied the regulation of HBV protein expression on the inflammatory response of hepatocytes / hepatoma cells and its mechanism. In order to elucidate the role of HBV protein and hepatocytes in the development of liver disease. 1. Construct recombinant vector of HBV protein expression. Transfection of hepatocytes / hepatoma cells. The expression trend of inflammatory effector molecules in hepatocytes / hepatoma cells at the transcriptional level was studied by fluorescence PCR. Enzyme linked immunosorbent assay (Elisa) and Western blot were used to study the expression of inflammatory effector molecules at protein level. 2. By using Western Blot and immunofluorescence assay, the signal pathway involved in the inflammatory effect of HBV protein and its role were studied with the help of specific signal pathway inhibitors. 3. HBV core antigen (HBC) was constructed and transformed into cells stably, and the role of HBc in cell proliferation was detected. 4. The role of HMGB1 in the proliferation of hepatoma cells induced by HBc was studied by transfection of siRNA, combined with Western Blot technique. Results 1. HBc and HBc can up-regulate IL-18. Expression of inflammatory genes such as IL-6 and TN 偽 mRNA; The expression of IL-6 and TNF 偽 mRNA was up-regulated by MHBsAg. The expression of TNF 偽 in SMMC-7721 L-02 and Huh7 cells was not affected, except for the up-regulation of TNF 偽 expression in SMMC-7721 L-02 and Huh7 cells. The expression of IL-6 was up-regulated in HBc and MHBs groups and reached a high level at 24 hours, in HepG2 and SMMC-7721 cells. The expression of TNF 偽 in MHBs and HBc groups reached a high level at 6 hours after transfection, and then decreased. In Huh7 and L-02 cells, the change trend was reversed. MHBs upregulated the expression of HMGB1 and reached a high level at 24 hours. In L-02 and SMMC-7721 cells, the expression of HMGB1 in L-02 and SMMC-7721 cells decreased with time. 2MHBs activate MAPKp38/NF-KB to promote the expression and secretion of IL-6, which depends on endoplasmic reticulum pressure; In Huh7 cells, MHBs activate NF- 魏 B to up-regulate the expression of HMGB1 and induce the transfer of HMGB1 from the nucleus to the cytoplasm. 3HBC stimulated the expression and secretion of IL-6 by activating MAPK p38 ERK1 / 2 and NF- 魏 B, but this effect was not related to endoplasmic reticulum pressure. In Huh7 cells, HBC activates NF- 魏 B to promote the expression of HMGB1, but does not induce the translocation of HMGB1 from nucleus to cytoplasm. HBc promoted the proliferation of Huh7 cells. HMGB1 siRNA inhibited the proliferation of HBc and the activation of ERK1/2 by HBc. Conclusion 1. The effects of the same HBV protein on different cell lines were not consistent. The response of the same cell line to different HBV proteins was also different. Generally speaking, MHBs and HBc of LHBs could induce the change of inflammatory gene expression. The expression of other inflammatory genes in hepatocytes / hepatoma cells was not significantly affected by SHBs except TNF 偽. 2MHBs induced endoplasmic reticulum pressure, activated p38 / NF- 魏 B pathway, up-regulated the expression and secretion of IL-6, enhanced the expression of HMGB1, and led to its transfer from nucleus to cytoplasm. MHBs mainly acts as a stress-stimulating factor in hepatocytes / hepatoma cells. 3HBC activated MAPK p38 ERK1 / 2 and NF- 魏 B, upregulated the expression of IL-6 and HMGB1, and promoted the proliferation of hepatoma cells. HBc, as a proinflammatory and proliferative factor, has multiple effects.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R512.62

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本文編號(hào)：1431371