發(fā)布時間：2018-01-16 03:01

  本文關鍵詞：神經(jīng)肽Y對癲癇大鼠海馬神經(jīng)元AMPA受體的影響及其作用機制　出處：《河北醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 神經(jīng)肽Y 癲癇 海馬神經(jīng)元 AMPA受體 AMPA誘導電流 凋亡

【摘要】：癲癇是一種臨床上常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,其表現(xiàn)主要是由于大腦神經(jīng)元反復的異常放電導致腦功能暫時性失常。其原因復雜,最近幾年,研究發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作區(qū)域會出現(xiàn)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的升高,突觸功能改變等大腦結構和功能的變化,這些變化又可以使得癲癇呈現(xiàn)反復發(fā)作的特點,是癲癇頻繁發(fā)作和難治的原因之一。谷氨酸受體功能異�？赡苁瞧湓�因之一,神經(jīng)肽Y(NPY)是由36個氨基酸殘基組成的多肽,廣泛分布在周圍神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng),在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,主要分布于丘腦、下丘腦、海馬、大腦皮層等部位,而尤以海馬處密度最高(Ledri M et al.,2011)。近幾年研究顯示NPY是一個強有力的內(nèi)源性抗癲癇因子(Cardoso A et al.,2010),文獻報道NPY在神經(jīng)元興奮性調(diào)節(jié)及抑制癲癇發(fā)作方面發(fā)揮著重要作用,但是至今NPY抑制癲癇發(fā)作的機制仍不十分清楚(S?rensen AT et al.,2009)。過去對其作用機制的研究大部分局限于NPY對神經(jīng)元的保護作用,認為NPY主要通過Y2和Y5受體抑制突觸前膜N型鈣通道,使鈣內(nèi)流減少,導致興奮性性遞質(zhì)谷氨酸釋放減少,從而抑制突觸后膜的興奮性傳遞,發(fā)揮抑制癲癇發(fā)作的作用(Silva AP et al.,2007),至于其如何引起鈣通道變化的中間環(huán)節(jié)及是否存在其他機制來發(fā)揮其抗癲癇作用,目前研究甚少。谷氨酸受體功能的變化可以導致體內(nèi)興奮性與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)失衡,誘發(fā)癲癇的發(fā)作及造成神經(jīng)元損傷,α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸(AMPA)受體是離子型谷氨酸三大受體之一,是除NMDA受體外另一類重要的興奮性氨基酸特異性受體,它主要介導快速的興奮性遞質(zhì)傳遞(Savtchouk I et al.,2011),廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),他的過度激活可以提高神經(jīng)元興奮性,在癲癇的發(fā)病中起著重要作用(Yue Hu et al.,2012)。我們推測NPY是否有可能通過調(diào)節(jié)AMPA受體的功能,抑制癲癇發(fā)作的作用?本實驗選用大鼠海馬神經(jīng)元癲癇樣放電模型,采用膜片鉗技術檢測NPY對大鼠海馬神經(jīng)元癲癇樣放電的影響,檢測NPY對細胞癲癇樣放電狀態(tài)下的AMPA電流的影響,檢測海馬神經(jīng)元癲癇樣放電狀態(tài)下的AMPA受體Glu2亞單位m RNA及總蛋白和蛋白磷酸化變化,以及NPY對其的影響,并檢測NPY對海馬神經(jīng)元癲癇樣放電后的相關凋亡指標的檢測,最后通過動物實驗驗證NPY是否作用于海馬神經(jīng)元AMPA受體抑制動物癲癇發(fā)作,探討NPY通過調(diào)節(jié)AMPA受體的生物活性、減弱興奮性神經(jīng)遞質(zhì)對神經(jīng)元的損害和抗癲癇發(fā)作的機制,本實驗共分四部分。第一部分神經(jīng)肽Y對癲癇樣放電狀態(tài)海馬神經(jīng)元AMPA電流的影響目的:以原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元為研究對象,用無鎂(Mg2+free)細胞外液處理3h,然后用正常細胞外液繼續(xù)培養(yǎng),進而進行全細胞膜片鉗實驗,比較海馬神經(jīng)元癲癇樣放電狀態(tài)下神經(jīng)肽Y對大鼠海馬神經(jīng)元AMPA電流的影響,探討神經(jīng)肽Y對AMPA受體功能的影響及其作用機理。方法:采用24h新生SD大鼠,取海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng),體外培養(yǎng)至第12d時,將海馬神經(jīng)元分為Control組、模型組(Mg2+free組),NPY(1μM)干預組,BIBP3226+NPY干預組。Control組換正常細胞外液處理3h,模型組只用無鎂細胞外液處理3h,NPY組細胞是先以含NPY(濃度為1μmol/L)的細胞培養(yǎng)液孵育0.5h,然后用無鎂細胞外液處理3h。BIBP3226+NPY干預組細胞先用含NPY Y1受體阻斷劑BIBP3226(終濃度為1μmol/L)的細胞培養(yǎng)液孵育0.5h,再加入終濃度為1μmol/L的NPY孵育0.5h,最后加入無鎂細胞外液處理3h。全細胞膜片鉗技術檢測Control組、模型組(Mg2+free組)和NPY(1μM)干預組的動作電位,全細胞膜片鉗技術檢測Control組、模型組(Mg2+free組)和NPY(1μM)干預組和BIBP3226+NPY干預組神經(jīng)元的AMPA電流(IAMPA),計算峰值電流密度。結果:膜片鉗實驗顯示模型組細胞出現(xiàn)穩(wěn)定的異常動作電位,動作電位的頻率和幅度明顯高于Control組,NPY(1μM)干預組動作電位的頻率和幅度都顯著低于模型組(P0.05)。模型組神經(jīng)元IAMPA峰值密度較對照組顯著降低(P0.05),NPY(1μM)干預組IAMPA峰值電流密度較模型組顯著升高(P0.05),BIBP3226+NPY干預組的神經(jīng)元IAMPA峰值電流密度較NPY干預組顯著下降(P0.05)。結論:模型組細胞在"無鎂細胞外液”處理3h后,細胞出現(xiàn)異常動作電位,可以模擬細胞癲癇樣放電,NPY預處理海馬神經(jīng)元可以抑制這種放電。海馬神經(jīng)元癲癇樣放電可以出現(xiàn)神經(jīng)元的IAMPA下降,NPY可以減輕癲癇樣放電對神經(jīng)元IAMPA的抑制,避免神經(jīng)元IAMPA的過度下降,NPY有可能通過調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元的AMPA受體功能,發(fā)揮抗癲癇作用。提前加入NPY Y1受體阻斷劑BIBP3226后,NPY的作用被抑制,提示NPY可能是通過激活Y1受體發(fā)揮對AMPA受體功能的調(diào)節(jié)。第二部分神經(jīng)肽Y對海馬神經(jīng)元癲癇樣放電狀態(tài)AMPA受體Glu R2亞單位的影響目的:以原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元細胞為研究對象,用無鎂(Mg2+free)細胞外液處理3h制作海馬神經(jīng)元癲癇樣放電模型,利用RT-PCR及Western blot法檢測海馬神經(jīng)元癲癇樣放電對AMPA受體Glu R2亞單位功能的影響,以及神經(jīng)肽Y(NPY)對癲癇樣放電海馬神經(jīng)元AMPA受體Glu R2功能的影響。方法:采用24h內(nèi)新生SD大鼠,取海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng),體外培養(yǎng)至第12d時,隨機分為Control組、模型組(Mg2+free組),NPY干預組和BIBP3226+NPY干預組,Control組換正常細胞外液處理3h,模型組只用無鎂細胞外液處理3h,NPY組是先以含NPY的細胞培養(yǎng)液孵育0.5h,然后用無鎂細胞外液處理3h,BIBP3226+NPY干預組先用含BIBP3226的細胞培養(yǎng)液孵育0.5h,再加入終濃度為1μmol/L的NPY孵育0.5h,最后加入無鎂細胞外液處理3h,所有各組恢復正常細胞外液培養(yǎng)1h。用免疫熒光測定海馬神經(jīng)元Control組、模型組(Mg2+free組),NPY干預組的AMPA受體Glu R2亞單位表達。應用RT-PCR法及Western blot法檢測Control組、模型組(Mg2+free組),NPY干預組和BIBP3226+NPY干預組中海馬神經(jīng)元的Glu R2m RNA表達水平及Glu R2亞單位的總蛋白和磷酸化變化。結果:免疫熒光染色顯示Control組神經(jīng)元外觀正常,細胞軸突表達Glu R2明顯,模型組神經(jīng)元Glu R2熒光表達明顯下降,NPY組神經(jīng)元Glu R2的表達較模型組有所增強。RT-PCR檢測顯示模型組Glu R2m RNA較對照組顯著下降(P0.05),NPY干預組Glu R2m RNA較模型組顯著上升(P0.05),BIBP3226+NPY干預組Glu R2m RNA較NPY組顯著下降(P0.05)。Western blot實驗顯示模型組Glu R2亞單位的蛋白含量較對照組輕微下降,結果無統(tǒng)計學意義(P0.05),模型組Glu R2亞單位的磷酸化水平較對照組顯著升高(P0.05),NPY(1μm)干預組Glu R2亞單位的磷酸化水平較模型組顯著下降(P0.05),BIBP3226+NPY干預組的Glu R2亞單位的磷酸化水平較NPY組顯著升高(P0.05)。結論:海馬神經(jīng)元在無鎂細胞外液孵育3h后可以出現(xiàn)AMPA受體Glu R2亞單位蛋白磷酸化增加、而未出現(xiàn)細胞內(nèi)總蛋白含量的明顯變化,Glu R2 m RNA的復制受抑制,說明海馬神經(jīng)元癲癇樣放電引起AMPA受體功能抑制的原因可能是由于Glu R2基因復制受抑制,蛋白出現(xiàn)磷酸化改變,以至神經(jīng)元突觸表面含正常Glu R2亞單位的AMPA受體減少、功能改變。神經(jīng)肽Y可以抑制海馬神經(jīng)元癲癇樣放電對AMPA受體Glu R2亞單位功能的過度抑制,這可能是其抑制癲癇的機制之一。應用神經(jīng)肽Y的Y1受體阻斷劑可以抑制神經(jīng)肽Y這一作用,提示神經(jīng)肽Y可能是通過與海馬神經(jīng)元上的Y1受體作用,來調(diào)節(jié)AMPA受體Glu R2功能。第三部分神經(jīng)肽Y通過影響AMPA受體減輕海馬神經(jīng)元癲癇樣放電后神經(jīng)元凋亡目的:以原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元細胞為研究對象,研究海馬神經(jīng)元癲癇樣放電后是否會出現(xiàn)凋亡及神經(jīng)肽Y是否可以通過影響海馬神經(jīng)元AMPA受體抑制凋亡的發(fā)生。方法:采用24h內(nèi)新生SD大鼠,取海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng),體外培養(yǎng)至第12d時,將細胞隨機分為Control組、模型組(Mg2+free組),NPY干預組和CNQX+NPY干預組,Control組換正常細胞外液處理3h,模型組只用無鎂細胞外液處理3h,NPY組是先以含NPY的細胞培養(yǎng)液孵育0.5h,然后用無鎂細胞外液處理3h,CNQX+NPY干預組預先用含CNQX的細胞培養(yǎng)液孵育0.5h,再加入終濃度為1μmol/L的NPY孵育0.5h,最后加入無鎂細胞外液處理3h。各組細胞恢復正常細胞培養(yǎng)液12小時,應用TUNEL法檢測各組神經(jīng)元細胞凋亡情況,應用Western blot法檢測各組神經(jīng)元細胞的Caspase-3蛋白的表達,應用RT-PCR法檢測各組神經(jīng)元細胞Caspase-3m RNA水平。結果:TUNEL法檢測顯示模型組較Control組海馬神經(jīng)元陽性神經(jīng)元明顯增加(P0.05),NPY干預組陽性神經(jīng)元明顯低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Western blot檢測顯示模型組Caspase-3的蛋白含量較對照組顯著升高(P0.05),RT-PCR法檢測顯示Caspase-3m RNA較對照組也顯著升高(P0.05),兩者變化一致。NPY干預組Caspase-3的蛋白水平較模型組顯著下降(P0.05),Caspase-3m RNA較模型組顯著下降(P0.05)。CNQX+NPY干預組的Caspase-3蛋白水平較NPY組顯著升高(P0.05),Caspase-3m RNA較NPY組顯著升高(P0.05)。結論:海馬神經(jīng)元癲癇樣放電后可以出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡,這與動物急性癲癇模型的表現(xiàn)是一致的。神經(jīng)肽Y可以抑制這種癲癇樣放電引起的神經(jīng)元凋亡,對神經(jīng)元有保護作用,應用AMPA受體阻斷劑CNQX后,神經(jīng)肽Y的這一作用被抑制,提示神經(jīng)肽Y可能是通過影響海馬神經(jīng)元AMPA受體的功能來發(fā)揮抗凋亡保護神經(jīng)元的作用。第四部分神經(jīng)肽Y對大鼠急性癲癇發(fā)作后Glu R2亞單位的影響及行為學改變目的:以SD大鼠為研究對象,通過觀察經(jīng)過海馬CA3區(qū)分別注射神經(jīng)肽Y和BIBP3226+神經(jīng)肽Y后,側(cè)腦室注射海人酸誘發(fā)大鼠急性癲癇發(fā)作,研究大鼠的行為學變化及海馬CA3區(qū)的Glu R2亞單位功能變化,探討神經(jīng)肽Y以海馬神經(jīng)元AMPA受體Glu R2亞單位為靶點對大鼠癲癇發(fā)作的影響。方法:將SD大鼠分為Control組、模型組(海人酸致癇組)、NPY干預組、BIBP3226+NPY干預組,每組10只。各組動物采用立體定向微量注射相應藥物,觀察各組大鼠的行為學表現(xiàn)。根據(jù)Racine的分級標準對大鼠癲癇發(fā)作程度進行評估,以Ⅰ-Ⅱ級為輕度發(fā)作,Ⅲ級以上為重度發(fā)作。腦室注射后12小時,每組取5只大鼠用Western blot法檢測各組動物海馬CA3區(qū)的Glu R2亞單位的總蛋白變化和磷酸化變化,RT-PCR方法檢測各組動物海馬CA3區(qū)的Glu R2m RNA表達水平。結果:20分鐘內(nèi),模型組大鼠出現(xiàn)癲癇重度發(fā)作,NPY干預組出現(xiàn)輕度發(fā)作,BIBP3226+NPY干預組的癲癇發(fā)作水平較NPY組顯著升高(P0.05),Control組未見癲癇發(fā)作。腦室注射后12小時,模型組Glu R2亞單位的蛋白含量與對照組性比無統(tǒng)計學變化(P0.05),Glu R2亞單位的磷酸化水平較對照組顯著升高(P0.05),Glu R2m RNA較對照組顯著下降(P0.05)。NPY干預組Glu R2亞單位的磷酸化水平較模型組顯著下降(P0.05),Glu R2m RNA較模型組顯著上升(P0.05)。BIBP3226+NPY干預組的Glu R2亞單位的磷酸化水平較NPY組顯著升高(P0.05),Glu R2m RNA較NPY組顯著下降(P0.05)。結論:腦室內(nèi)注射海人酸可以誘發(fā)癲癇發(fā)作,可以引起海馬AMPA受體Glu R2亞單位表達受抑制,NPY可以抑制癲癇發(fā)作,其機制可能是通過激活海馬神經(jīng)元Y1受體而抑制Glu R2亞單位功能下調(diào),來抑制大鼠癲癇的發(fā)生,更進一步證明我們的細胞實驗。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R742.1

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