發(fā)布時間：2018-01-15 00:06

  本文關鍵詞：雷公藤多甙調控NE、Trappin-2對HaCaT細胞增殖和炎癥的影響　出處：《山東大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 銀屑病 中性粒細胞彈性蛋白酶(NE) Trappin-2 雷公藤多甙

【摘要】：研究背景:銀屑病是一種以角質形成細胞過度增殖和免疫細胞浸潤為特征的慢性炎癥性皮膚病,由遺傳、環(huán)境和免疫等多種因素共同作用導致形成。世界范圍內發(fā)病率是1%-3%,并呈持續(xù)增長趨勢。約3%-10%銀屑病患者表現(xiàn)出炎癥性皮損。另外,銀屑病并發(fā)的關節(jié)炎、非酒精性脂肪肝、骨關節(jié)病、心血管病和代謝綜合征等嚴重疾病更增加了患者的生理、心理和經濟負擔。銀屑病最常見的類型是尋常型,該類患者特征性的病理改變是表皮處中性粒細胞(Polymorphonuclear neutrophils,PMNs)聚集形成的 Munro 微膿瘍。Munro微膿瘍僅存于角化不全區(qū)域,該區(qū)角質形成細胞(Keratinocytes,KCs)增生活躍。膿皰型銀屑病的炎癥特點更為顯著,值得一提的是,與尋常型相比,該類型患者表皮的海綿狀微膿瘍(Kogoj膿腫)中PMNs的浸潤尤為明顯,KCs的增殖也更顯著。這些發(fā)現(xiàn)均支持PMNs在銀屑病的KCs增殖和炎癥反應以及疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。主要由PMNs合成、儲存和釋放的中性粒細胞彈性蛋白酶(Nertrophil elastase,NE)是人體一種重要的蛋白酶,屬于絲氨酸蛋白酶的糜蛋白酶超家族成員。NE一直是PMNs研究的熱點和焦點。中性粒細胞浸潤部位的銀屑病皮損的增殖速度加快,這可能是由于NE通過表皮生長因子受體EGFR信號通路刺激角質細胞增殖導致的。NE還能促進細胞間粘附分子ICAM-1和炎癥因子的表達和分泌,這些病理改變會引起角質細胞增生和分化、血管擴張及炎性細胞浸潤到表皮和真皮等改變。ICAM-1是一種在細胞受到內毒素LPS或炎性細胞因子(如IL-1、IL-6和TNF-α)等刺激時才會大量表達的重要炎癥因子,參與PMNs的粘附定植和PMNs與內皮細胞、KCs與T細胞的粘附,在無菌炎癥性組織損傷反應中起到了重要的作用。研究發(fā)現(xiàn),在進行期銀屑病的皮損處,ICAM-1的釋放量明顯高于正常對照組;斑塊型銀屑病患者的血清可溶性ICAM-1 (sICAM-1)的含量在銀屑病患者中的水平明顯高于健康人,皮損處的ICAM-1表達也大量增加,并且升高的水平與皮損面積正相關。此外,在銀屑病患者皮損處和循環(huán)中可檢測到過度釋放的促炎性細胞因子包括腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白細胞介素-6 (IL-6)和白細胞介素-8 (IL-8),并產生級聯(lián)反應。Trappin-2能夠抑制NE的活性并促使其降解,它是內源性NE的一種抑制劑,主要由角質形成細胞及上皮細胞分泌。大量研究顯示Trappin-2在炎癥性皮膚病及皮膚腫瘤中顯著高表達。Trappin-2能夠降低IL-6、IL-8和ICAM-1等炎癥增強因子的表達,同時抑制角質細胞的增殖。膿皰性銀屑病以中性粒細胞浸潤為顯著特征,Tanaka等研究發(fā)現(xiàn)該類患者皮損處NE的表達明顯升高,同時進一步研究發(fā)現(xiàn)低濃度的NE可以誘導Trappin-2的表達,但當皮損炎癥程度加重、NE濃度過高時則抑制Trappin-2的表達,NE/Trappin-2比例升高,比如尋常型銀屑病患者皮損處Trappin-2的水平明顯高于膿皰型銀屑病患者,因此可以根據(jù)NE/Trappin-2比例判斷銀屑病的嚴重程度。已有的研究表明,NE可以顯著促進體外HaCaT角質細胞增殖和代謝,而Trappin-2通過抑制NE活性減緩HaCaT角質細胞的增殖。因此,NE和Trappin-2之間的平衡在銀屑病的增殖和炎癥反應中起重要作用。目前,已有研究證明對銀屑病患者進行早期干預,可以顯著降低患者的系統(tǒng)性炎癥反應并緩解癥狀,但銀屑病發(fā)病機制復雜,所以其靶向藥物仍有限。治療銀屑病的主要方法包括常規(guī)的全身性治療(如甲氨蝶呤、阿維A、環(huán)孢素和光化學療法)和生物制劑(如依法利珠單抗、依那西普、英夫利昔單抗和阿達木單抗)和。然而,這些治療方法存在許多潛在的副作用包括發(fā)熱、疲勞、皮膚瘙癢和其他癥狀。目前只有25%的銀屑病患者對該病的治療效果感到滿意。除上述問題之外,這些試劑的單靶點部位和高昂的價格也限制了其臨床開發(fā)和應用。因此,迫切需要進一步開發(fā)該病的有效治療方法。雷公藤多試(Tripterygium wilfordii polycoride, TWP)是一種從傳統(tǒng)中藥雷公藤中提取的水氯仿提取物,具有免疫抑制、抗炎、抗腫瘤等生物學活性,從而改善機體的炎癥狀態(tài)和免疫功能。目前TWP已被廣泛用于自身免疫性疾病和炎癥相關的疾病的臨床治療并取得了較為公認的療效。Meta分析證實雷公藤對進展期的各型銀屑病均有效果,但是仍不清楚其發(fā)揮治療作用可能的分子機制。因此,在本文中,我們決定深入研究雷公藤多甙治療銀屑病的作用機制以及NE與Trappin-2的平衡是否也參與其潛在的分子機制中,為雷公藤多甙治療銀屑病的作用靶點提供更充分的科學依據(jù)。目的:通過構建兩種體外損傷模型,NE誘導的HaCaT細胞增殖模型和TNF-α與NE聯(lián)合誘導的HaCaT細胞炎癥模型,研究雷公藤多甙對HaCaT細胞增殖活力、炎癥因子分泌以及ICAM-1表達的影響,探討其抑制HaCaT細胞增殖和炎癥細胞表達的作用機制。方法:1、用不同濃度NE在不同時間下刺激HaCaT細胞,通過比較細胞增殖活力及炎性因子的水平,確定NE的最適作用濃度和時間;分別用不同濃度Trappin-2、TWP在不同時間下對HaCaT細胞進行細胞毒性檢測,確定Trappin-2和TWP的最適作用濃度及時間。2、用NE誘導HaCaT細胞增殖模型,觀察TWP和Trappin-2干預下,HaCaT細胞增殖的改變。3、用TNF-α和NE聯(lián)合誘導HaCaT細胞炎癥模型,觀察TNF-α和NE對HaCaT細胞增殖活力及炎癥因子表達的作用;給予TWP和Trappin-2進行干預,觀察TWP和Trappin-2的干預作用對模型的影響。4、用CCK-8試劑盒檢測HaCaT細胞增殖的變化。5、用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測培養(yǎng)細胞上清液中白細胞介素-6 (IL-6)、白細胞介素-8 (IL-8)、NE與Trappin-2蛋白的水平。6、用Western Blot檢測細胞內粘附分子-1 (ICAM-1)的表達。結果:1、NE對HaCaT細胞增殖及其炎癥因子水平的影響(1) NE以1和10 IU/L的劑量預處理12、24和48 h后HaCaT細胞活力明顯增加(P0.05),但是NE (50和100 IU/L)預處理12、24和48 h后HaCaT細胞活力則顯著降低(P0.05)。(2)NE 在濃度 0.1-100 IU/L 預處理 12、24 和 48 h 后對 HaCaT 細胞的 IL-6、IL-8以及ICAM-1的表達水平略有改變,但與作用時間和濃度無明顯相關性,結果無顯著差異(P0.05)。(3)低濃度NE顯著增加HaCaT細胞中的Trappin-2水平,高濃度NE降低Trappin-2 水平。因此,選擇濃度10 IU/L和刺激時間24h為NE的最適刺激濃度和作用時間。2、Trappin-2對HaCaT細胞增殖的影響10-100ng/ml的Trappin-2處理12 h后HaCaT細胞增殖活力略有變化,結果無顯著性差異(P0.05)。但是,Trappin-2在25-100ng/ml濃度下預處理24或48 h能顯著降低HaCaT細胞增殖活力(P0.05),且該改變呈劑量依賴性。綜合以上數(shù)據(jù)分析,選擇濃度25ng/ml和刺激時間24h為Trappin-2最適刺激濃度和最適作用時間。3、TWP對HaCaT細胞增殖的影響與對照組(TWP=0μg/ml)相比,TWP (1-100μg/ml)對HaCaT細胞增殖活力略有改變,結果無顯著性差異(P0.05),表明HaCaT細胞在TWP(100μg/ml)時沒有明顯的毒性作用。并且與NE組相比,50μg/ml的TWP處理24h后,能夠最大限度地降低NE對HaCaT的增值作用。綜上分析,最終確定濃度50μg/ml和刺激時間24h為TWP的最佳刺激濃度和時間。4、TWP/Trappin-2對低濃度NE誘導的HaCaT細胞增殖模型的影響(1) TWP/Trappin-2對低濃度NE誘導的HaCaT細胞活力的影響NE (10IU/L)預處理24h后與對照組相比HaCaT細胞活力明顯增加(P0.01)。此外,TWP和Trappin-2對HaCaT細胞活力沒有明顯改變(P0.05)。但是相比于NE組,用TWP (50μg/ml)或Trappin-2 (25ng/ml)處理24h可以顯著降低10 IU/LNE處理24 h后的HaCaT細胞活力(P0.05)。(2) TWP/Trappin-2對低濃度NE誘導的HaCaT細胞中NE和,Trappin-2平衡的影響NE (10IU/L)預處理24h后與對照組相比,HaCaT細胞中NE和Trappin-2水平顯著上升(P0.01)。此外,TWP和Trappin-2對NE和Trappin-2水平未產生明顯改變。但是,和NE組相比,用TWP (50μg/ml)或Trappin-2 (25ng/ml)處理24h可以顯著下調HaCaT細胞中NE水平并顯著上調Trappin-2水平(P0.05)。因此,HaCaT細胞中NE和Trappin-2的比值和對照組相比顯著增加,用50μg/ml TWP或25ng/ml Trappin-2處理24h可以顯著降低這個比例(P0.05)。5、TWP/Trappin-2對TNF-α和聯(lián)合NE誘導HaCaT細胞炎癥模型的影響(1)與對照組相比,TNF-α (10ng/ml)以及TNF-α+NE聯(lián)合處理HaCaT細胞后,IL-6、IL-8、NE 和 Trappin-2 水平及 NE/Trappin-2 比值顯著增加(P0.05)。(2)與TNF-α組和TNF-α+NE組相比,TWP處理TNF-α+NE聯(lián)合誘導的HaCaT細胞模型后IL-6、IL-8和NE水平顯著降低,Trappin-2水平顯著增加(P0.05)。Trappin-2處理TNF-α+NE聯(lián)合誘導的HaCaT細胞模型后IL-6、IL-8、NE和Trappin-2的表達與TWP的結果類似(P0.05)。(3)與對照相比,TNF-α+NE處理后,HaCaT細胞表達ICAM-1蛋白的水平顯著增加(P0.05)。TWP/Trapin-2刺激TNF-α+NE聯(lián)合誘導的HaCaT細胞模型后,ICAM-1的表達顯著降低(P0.05)。結論:1.低濃度的NE(≤10IU/L)可以顯著增加HaCaT細胞活力和Trappin-2水平,而高濃度NE(≥50IU/L)則抑制HaCaT細胞活力,降低Trappin-2的表達。2.在Trappin-2濃度大于25ng/ml,作用時間大于24h的情況下,HaCaT細胞的活力被顯著地抑制,并且不隨濃度的升高而發(fā)生變化。3. TWP濃度≤100μg/ml,作用時間≤48h,HaCaT細胞活力的改變無統(tǒng)計學意義,說明在此條件下,TWP對HaCaT細胞無明顯的細胞毒作用,并且不顯著改變NE和Trappin-2的表達。4.TWP (50μg/ml)和 Trappin-2 (25ng/ml)處理 24h,可以有效地抑制 NE 誘導的HaCaT細胞增殖,并顯著降低NE水平,上調Trappin-2水平以及降低NE/Trappin-2 比值。5. TWP或Trappin-2能明顯抑制NE+TNF-α誘導的HaCaT細胞IL-6和IL-8的上調,以及顯著降低NE含量和NE/Trappin-2比值,上調Trappin-2水平。此外,TWP或Trappin-2能夠下調ICAM-1的蛋白表達。6. TWP對NE/Trappin-2及HaCaT增殖的影響與Trappin-2具有類似的作用,說明TWP可能是Trappin-2的一種潛在激活劑。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R758.63

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本文編號：1425888