發(fā)布時(shí)間：2018-01-12 15:26

  本文關(guān)鍵詞：化瘀丸對(duì)4T1乳腺癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的干預(yù)作用及其基于血小板途徑的抗腫瘤機(jī)制的研究　出處：《北京中醫(yī)藥大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景:乳腺癌是世界范圍內(nèi)女性最好發(fā)的惡性腫瘤,并且是女性癌因性死亡的第二大疾病。引發(fā)患者死亡的最主要原因是腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。最新的研究發(fā)現(xiàn)許多惡性腫瘤患者會(huì)出現(xiàn)血液高凝狀態(tài),這種血液高凝狀態(tài)會(huì)增加患者轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)�？v觀腫瘤微環(huán)境,血小板在形成血液高凝狀態(tài)和促進(jìn)腫瘤血行轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用�；罨�的血小板可以與腫瘤細(xì)胞形成復(fù)合物,保護(hù)血管中的腫瘤細(xì)胞免于被高剪切血流和宿主免疫系統(tǒng)消除,這將有利于腫瘤細(xì)胞粘附到血管的內(nèi)皮細(xì)胞并外滲。此外,腫瘤細(xì)胞可以刺激血小板活化,腫瘤細(xì)胞表面和血小板細(xì)胞膜上的整合蛋白integrins以受體和配體的形式相結(jié)合,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞和血小板之間的粘附。整合蛋白是由在血小板中大量表達(dá)的非共價(jià)連接的α和β亞基組成的跨膜粘附受體家族。在乳腺癌中,β 3和β1整合蛋白的表達(dá)已經(jīng)被研究證實(shí)支持血小板與腫瘤細(xì)胞的相互作用,允許腫瘤細(xì)胞粘附到脈管系統(tǒng)并由此轉(zhuǎn)移。因此,下調(diào)血小板活化可能是緩解血液高凝狀態(tài)和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的有效策略。目前的抗血小板藥物如肝素和阿司匹林被證實(shí)是通過(guò)消耗全身血小板來(lái)顯示出對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的治療功效。然而,這種治療策略具有臨床局限性,因?yàn)檫@一治療策略與一些并發(fā)癥例如胃腸出血和出血性中風(fēng)相關(guān),特別是在由于化療或放射治療已經(jīng)出現(xiàn)血小板減少的患者中。因此,應(yīng)該研究更安全同時(shí)保證有效的抗血小板藥。化瘀丸是以"益氣活血解毒"為治則組成的中藥方劑,用于防治惡性腫瘤,并在臨床中顯示出抗腫瘤效果。化瘀丸的藥理學(xué)研究顯示,姜黃素是化瘀丸中單體成分之一。從植物中提取的姜黃素是對(duì)人沒(méi)有顯著毒性的自然界的化合物,并已應(yīng)用在各種病癥的防治中。越來(lái)越多的證據(jù)表明姜黃素是一種高度多效的分子,具有不同的生物活性。雖然廣泛的研究表明姜黃素具有抗腫瘤作用,但其抗轉(zhuǎn)移效能和基礎(chǔ)機(jī)制幾乎沒(méi)有報(bào)告。實(shí)驗(yàn)方法:體外實(shí)驗(yàn):我們采用MTT法、ECIS細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析儀來(lái)研究中藥復(fù)方化瘀丸、中藥單體姜黃素對(duì)4T1乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)和電擊損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HYW含藥血清、姜黃素對(duì)4T1乳腺癌細(xì)胞遷移、損傷修復(fù)能力的影響。采用Western blot的方法檢測(cè)在4T1細(xì)胞總蛋白中MAPK信號(hào)通路和PI3K信號(hào)通路蛋白的表達(dá)量。體內(nèi)實(shí)驗(yàn):建立乳腺癌原位移植瘤小鼠模型,分別給予化瘀丸、姜黃素口服干預(yù),檢測(cè)腫瘤體積、重量、生物發(fā)光情況,并檢測(cè)肺轉(zhuǎn)移灶的面積、個(gè)數(shù),肺重,來(lái)觀察化瘀丸及姜黃素對(duì)原位瘤和轉(zhuǎn)移瘤的干預(yù)作用。凝血四項(xiàng)中檢測(cè)APTT、PT、Fbg,血小板計(jì)數(shù)來(lái)檢測(cè)治療后血小板個(gè)數(shù)的改變。血栓彈力圖檢測(cè)血小板功能。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板活化和凋亡。Western blot檢測(cè)腫瘤組織中整合蛋白integrins的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:MTT法、ECIS細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析儀均證明HYW含藥血清、姜黃素對(duì)4T1細(xì)胞有增殖抑制作用,并且這種抑制作用呈現(xiàn)出劑量依賴和時(shí)間依賴。ECIS細(xì)胞電擊損傷實(shí)驗(yàn)證實(shí)各濃度HYW含藥血清、Cur-luM組、Cur-1OuM組和Cur-30uM組姜黃素對(duì)4T1細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移能力有明顯的抑制作用。我們檢測(cè)了 MAPK通路中P38蛋白和ERK蛋白的表達(dá),同時(shí)檢測(cè)了磷酸化的P38蛋白和磷酸化的ERK蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比,化瘀丸組和姜黃素組的磷酸化的P38蛋白和磷酸化的ERK蛋白表達(dá)量明顯下降。我們檢測(cè)了 PI3K通路中PI3K蛋白和AKT蛋白的表達(dá),同時(shí)檢測(cè)了磷酸化的PI3K蛋白和磷酸化的AKT蛋白的表達(dá),與空白對(duì)照組相比,化瘀丸組和姜黃素組的磷酸化的PI3K蛋白和磷酸化的AKT蛋白表達(dá)量明顯下降。我們用4T1乳腺癌細(xì)胞和BALB/C小鼠建立了小鼠乳墊原位移植瘤模型,給予不同劑量化瘀丸和不同劑量姜黃素治療。小動(dòng)物活體成像技術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明連續(xù)給藥3周后,HYW-L與和HYW-H均能降低原位腫瘤的光子數(shù),然而,HYW-L只表現(xiàn)出抑制腫瘤生長(zhǎng)的趨勢(shì),并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HYW-H組對(duì)腫瘤的光子數(shù)的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。犧牲小鼠取得腫瘤后,稱量腫瘤重量,結(jié)果與小動(dòng)物成像儀所得結(jié)果相一致,HYW-H表現(xiàn)出良好的抑瘤效果。連續(xù)給藥21天,每周2次應(yīng)用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑(length)和短徑(width),按照公式計(jì)算腫瘤體積。根據(jù)腫瘤體積繪制生長(zhǎng)曲線,隨給藥時(shí)間的延續(xù)動(dòng)態(tài)觀察各組小鼠腫瘤體積的變化趨勢(shì)。HYW-L組和HYW-H組原位腫瘤的瘤體積的增長(zhǎng)持續(xù)低于模型組。犧牲小鼠后取小鼠完整肺臟,稱重記錄,治療組肺重低于模型組,肺轉(zhuǎn)移灶面積和肺轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)低于模型組。HYW組和Cur組治療后PLT并未發(fā)現(xiàn)改變。模型組小鼠和正常小鼠相比,PT明顯下降,表明乳腺癌荷瘤小鼠血液處于高凝狀態(tài)。經(jīng)過(guò)化瘀丸、姜黃素治療后,荷瘤小鼠PT上升,與模型組相比有明顯差異。模型組小鼠和正常小鼠相比,APPT明顯下降,表明乳腺癌荷瘤小鼠血液處于高凝狀態(tài)。經(jīng)過(guò)化瘀丸、姜黃素分別治療后,荷瘤小鼠APPT上升,并且APTT的上升隨著姜黃素劑量的增加而增加。血栓彈力圖結(jié)果顯示,與正常小鼠相比,負(fù)荷腫瘤的小鼠顯示出較短的R時(shí)間,表明血凝過(guò)快,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。與對(duì)照組相比,化瘀丸、姜黃素治療組的R時(shí)間增加。MA值振幅的成對(duì)比較顯示正常組和對(duì)照組之間的顯著差異(P0.05)。通過(guò)呈現(xiàn)高M(jìn)A值,我們?cè)诤闪鲂∈笾杏^察到血小板功能亢進(jìn)導(dǎo)致的高凝狀態(tài)。用不同濃度的化瘀丸、姜黃素治療,結(jié)果顯示化瘀丸、姜黃素可以以劑量依賴的方式降低荷瘤小鼠血液中血小板的功能亢進(jìn)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析,我們發(fā)現(xiàn)化瘀丸、姜黃素可以在很大程度上抑制血小板中的P-選擇素表達(dá)。用不同濃度的化瘀丸,姜黃素治療腫瘤負(fù)荷的小鼠,導(dǎo)致凋亡的血小板比例以劑量依賴性方式增加。化瘀丸及其單體成分姜黃素對(duì)腫瘤組織中與細(xì)胞粘附分子相關(guān)的整合蛋白integrin β1 和 integrin β3 有下調(diào)作用。結(jié)論:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)化瘀丸及其單體成分姜黃素能有效地抑制乳腺癌4T1細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)化瘀丸及其單體成分姜黃素有效地緩解了乳腺癌荷瘤小鼠的血液高凝狀態(tài),原位腫瘤和肺轉(zhuǎn)移也得到了一定程度的抑制。進(jìn)一步探索機(jī)制,化瘀丸及姜黃素通過(guò)降低血液高凝狀態(tài),抑制血小板活化,下調(diào)β1和β3整聯(lián)蛋白的表達(dá),減弱腫瘤細(xì)胞和血小板之間的相互作用,從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

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本文編號(hào)：1414843