發(fā)布時(shí)間：2018-01-08 10:08

  本文關(guān)鍵詞：Fbxw7通過(guò)泛素化蛋白酶解YAP誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)停滯　出處：《西安交通大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景:原發(fā)性肝癌(Primary liver cancer,PLC)是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,病死率在各種癌癥病死率中居第2位,其中肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)占PLC的90%以上。HCC發(fā)病率逐年升高,隨著高危人群篩查、肝移植技術(shù)的成熟、影像學(xué)早期診斷以及經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞(Transcatheter arterial chemoembolization,TACE)、射頻消融(Radiofrequency ablation,RFA)和索拉菲尼(Sorafenib)等輔助治療的臨床應(yīng)用,HCC患者的預(yù)后較前已經(jīng)有了明顯的改善,但總體上還未取得令人滿意的療效。分子靶向藥物索拉菲尼的臨床應(yīng)用彌補(bǔ)了晚期HCC患者治療手段的空缺,因此,進(jìn)一步明確HCC發(fā)生發(fā)展涉及的精確分子機(jī)制,探索HCC早期診斷分子標(biāo)志物、設(shè)計(jì)有效的腫瘤治療分子靶點(diǎn)以及患者預(yù)后指示標(biāo)志物,對(duì)提高我國(guó)肝癌的治療水平和改善腫瘤患者預(yù)后具有重要意義。泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解通路是基因和蛋白質(zhì)功能的主要調(diào)節(jié)者和終結(jié)者,控制著真核細(xì)胞內(nèi)絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的降解,因此,對(duì)該通路的調(diào)控已成為疾病治療中的一種創(chuàng)新性方法。F 框/WD-40 域蛋白 7(F-box and WD repeat domain-containing 7,Fbxw7)是SCF(Skpl-Cullinl-F-box)類泛素連接酶E3復(fù)合體中特異性識(shí)別底物的關(guān)鍵因子,能夠靶向泛素化降解 CyclinE,c-Myc,c-Jun,Mcl-1(Myeloid cell leukemia-1)和 Notch等癌蛋白,從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并增加化療敏感性。研究表明Fbxw7在多種惡性腫瘤中表達(dá)缺失,其低表達(dá)與患者不良預(yù)后密切相關(guān),是一種廣泛的抑癌基因。p53在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)Fbxw7基因表達(dá),p53-/+Fbxw7-/+基因敲除小鼠和受輻射的Fbxw7-/+小鼠均自發(fā)產(chǎn)生包括HCC在內(nèi)的多種腫瘤,提示Fbxw7與HCC的發(fā)生發(fā)展存在著某種聯(lián)系。Fbxw7的多個(gè)靶蛋白如CyclinE,c-Myc,c-Jun和Notch等在HCC中存在表達(dá)異常,且與HCC增殖、凋亡、耐藥及不良預(yù)后密切相關(guān)。Hippo信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物中是一個(gè)高度保守有效的細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡調(diào)控因子,在許多人類腫瘤特別是HCC中存在該通路的異常,而該通路的核心效應(yīng)分子是Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein,YAP)。在HCC和乳腺癌中YAP被鑒定為位于11q22擴(kuò)增子的一個(gè)促癌基因,YAP轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)肝臟體積明顯增大并最終產(chǎn)生腫瘤,臨床研究發(fā)現(xiàn)YAP是一個(gè)與HCC患者無(wú)病生存期和總生存期相關(guān)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素,提示Hippo-YAP信號(hào)通路在HCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著極其重要的作用。有研究使用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用(Liquid chromatograph-mass spectrometer/mass spectrometer,LC-MS/MS)技術(shù)分析有絲分裂相關(guān)蛋白磷酸化位點(diǎn),YAP蛋白共鑒定出17條磷酸肽和16個(gè)磷酸化位點(diǎn),其中S131和T141位點(diǎn)[(L)-V-pS-P-(P)-G-pT]包含F(xiàn)bxw7結(jié)合的保守 CDC4 磷酸決定子(CDC4 phospho-degron,CPD)序列[(L)-X-pT/pS-P-(P)-X-pS/pT/E/D],提示YAP可能是Fbxw7潛在的靶蛋白。Fbxw7在HCC中是否表達(dá)異常?是否與HCC臨床病理特征相關(guān)?其表達(dá)變化是否影響HCC的增殖及凋亡?確切的分子機(jī)制是否涉及Hippo-YAP信號(hào)通路?目前尚不清楚。目的:本實(shí)驗(yàn)旨在探討Fbxw7在HCC的表達(dá)及其對(duì)HCC細(xì)胞增殖和凋亡的影響,研究Fbxw7在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用,并初步探討其可能的分子機(jī)制,為尋找HCC新的治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。方法:1.應(yīng)用免疫組化染色、Western blot和qRT-PCR檢測(cè)Fbxw7在HCC及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá),分析Fbxw7與HCC臨床病理特征的相關(guān)性。2.應(yīng)用qRT-PCR鑒定Fbxw7 mRNA在永生化人肝細(xì)胞系L02和HCC細(xì)胞系HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Bel-7402 及 Huh7 的表達(dá)水平。3.應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的Flag-Fbxw7和Fbxw7-shRNA分別轉(zhuǎn)染HepG2和Hep3B細(xì)胞,qRT-PCR和Western blot檢測(cè)Fbxw7表達(dá)變化,流式細(xì)胞術(shù)、Caspase3/7活性分析、BrdU細(xì)胞增殖分析和MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡變化。4.應(yīng)用免疫組化染色檢測(cè)YAP在HCC及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá),分析YAP與Fbxw7蛋白蛋白表達(dá)相關(guān)性。5.應(yīng)用 Flag-Fbxw7 和 Fbxw7 shRNA 分別轉(zhuǎn)染 HepG2 和 Hep3B 細(xì)胞,qRT-PCR、Western blot和免疫熒光染色檢測(cè)YAP表達(dá)變化。6.HEK293細(xì)胞共轉(zhuǎn)染Flag-Fbxw7和HA-YAP,免疫共沉淀檢測(cè)Fbxw7與YAP之間的相互作用;Flag-Fbxw7轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)HA-YAP的HepG2細(xì)胞,免疫共沉淀檢測(cè)YAP蛋白泛素化水平變化;CHX追蹤分析檢測(cè)Fbxw7過(guò)表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞中YAP蛋白半衰期的影響。7.HA-YAP 轉(zhuǎn)染 Fbxw7 過(guò)表達(dá)的 Hep3B 細(xì)胞,Western blot 檢測(cè) Fbxw7 和 YAP 蛋白表達(dá)變化,流式細(xì)胞術(shù)、Caspase3/7活性分析、BrdU細(xì)胞增殖分析和MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡變化。8.分別應(yīng)用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EV、Flag-Fbxw7及Flag-Fbxw7+HA-YAP的Hep3B細(xì)胞構(gòu)建裸鼠皮下種植瘤模型,繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線;免疫組化和TUNEL技術(shù)檢測(cè)各組瘤體標(biāo)本中YAP、Ki-67和凋亡變化。結(jié)果:1.Fbxw7在HCC組織中的表達(dá)水平顯著低于對(duì)應(yīng)癌旁組織(P0.01);Fbxw7蛋白在較大腫瘤體積(≥5cm)、血管侵犯、高TNM分期和高病理分級(jí)的HCC組織中表達(dá)顯著降低(P0.05)。2.所有細(xì)胞系中均能檢測(cè)到Fbxw7 mRNA表達(dá),其在LO2細(xì)胞中表達(dá)最高,SMMC-7721細(xì)胞中表達(dá)最低。3.Fbxw7過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)停滯(P0.01);敲低Fbxw7導(dǎo)致Hep3B細(xì)胞凋亡抵抗和生長(zhǎng)加速(P0.01)。4.YAP在HCC組織中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織(P0.01);Fbxw7與YAP蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.572,P=0.003)。5.在HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Fbxw7不影響YAP mRNA表達(dá),但下調(diào)YAP蛋白水平(P0.01);在Hep3B細(xì)胞中敲低Fbxw7不影響YAP mRNA表達(dá),但導(dǎo)致YAP蛋白蓄積(P0.01)。6.Fbxw7與YAP蛋白存在相互作用,過(guò)表達(dá)Fbxw7導(dǎo)致HepG2細(xì)胞中YAP蛋白泛素化水平升高且半衰期縮短。7.恢復(fù)YAP蛋白表達(dá)能夠部分消除Fbxw7誘導(dǎo)的Hep3B細(xì)胞體外凋亡和生長(zhǎng)阻滯(P0.01)。8.Fbxw7顯著抑制Hep3B細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng),恢復(fù)YAP蛋白表達(dá)能部分逆轉(zhuǎn)Fbxw7對(duì)Hep3B細(xì)胞的體內(nèi)凋亡誘導(dǎo)和生長(zhǎng)抑制作用(P0.01)。結(jié)論:1.Fbxw7低表達(dá)與HCC惡性臨床病理特征相關(guān),且Fbxw7與癌蛋白YAP表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān),Fbxw7可能作為潛在的HCC患者預(yù)后指示分子。2.Fbxw7通過(guò)泛素化蛋白酶解負(fù)向調(diào)控YAP蛋白的穩(wěn)定性,YAP可能是Fbxw7的一個(gè)新靶蛋白。3.YAP蛋白能部分逆轉(zhuǎn)Fbxw7對(duì)HCC細(xì)胞的體內(nèi)外凋亡誘導(dǎo)和生長(zhǎng)抑制作用,Fbxw7可能通過(guò)Hippo-YAP信號(hào)通路發(fā)揮抑癌功能。
[Abstract]:Background : Primary liver cancer ( PLC ) is one of the most common malignant tumors in China . The mortality of HCC is more than 90 % of PLC . p53 - / + Fbxw7 - / + knockout mice and irradiated Fbxw7 - / + mice spontaneously produce a variety of tumors , including HCC , suggesting that Fbxw7 is associated with the development of HCC . The expression of Fbxw7 mRNA in HCC and HCC cell line HepG2 , Hep3B , 7721 , BEL - 7402 and Huh7 were determined by immunohistochemical staining , Western blot and Western blot . The expression of Fbxw7 in HCC tissues was significantly lower than that in adjacent tissues ( P0.01 ) . The expression of Fbxw7 in HCC tissues was significantly lower than that in adjacent tissues ( P0.01 ) .

【學(xué)位授予單位】：西安交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

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