低溫是細(xì)菌生存面臨的一種主要環(huán)境脅迫因素。細(xì)菌急性暴露于低溫環(huán)境時(shí),為應(yīng)對(duì)這種變化細(xì)胞將產(chǎn)生一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng),即冷激反應(yīng)。在冷激反應(yīng)中會(huì)大量誘導(dǎo)合成一類小分子蛋白質(zhì)家族統(tǒng)稱為冷激蛋白(cold shock proteins,Csps)。大量的實(shí)驗(yàn)表明,冷激蛋白在適應(yīng)低溫脅迫和正常生長(zhǎng)過(guò)程中都起到重要作用。耐輻射異常球菌(Deinococcus radiodurans)能生存于多種極端環(huán)境,但其冷脅迫的應(yīng)答反應(yīng)尚不清楚,特別是冷激蛋白Csp介導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制報(bào)道甚少。本研究以耐輻射異常球菌作為研究對(duì)象,利用RNA-Seq技術(shù)測(cè)定正常和冷激條件下野生型菌株和csp突變株的轉(zhuǎn)錄組,并進(jìn)一步用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證,測(cè)定其相關(guān)生理生化表型,探討了Csp的作用機(jī)制,取得如下結(jié)果:1.Western Blot結(jié)果顯示,Csp在冷激4 h后開(kāi)始大量積累,具備冷激反應(yīng)的基本特征。為了揭示耐輻射異常球菌冷激反應(yīng)的過(guò)程,開(kāi)展了該菌在正常條件和冷脅迫條件下(15°C,4 h)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)定,分析結(jié)果表明,冷脅迫導(dǎo)致199個(gè)基因表達(dá)上調(diào),642個(gè)基因表達(dá)下調(diào),其中包括了低溫信號(hào)感應(yīng),傳遞和應(yīng)答的過(guò)程所涉及的代謝通路。...

【文章頁(yè)數(shù)】：108 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 細(xì)菌冷激反應(yīng)的研究進(jìn)展
        1.1.1 冷激反應(yīng)的定義
        1.1.2 冷信號(hào)的感應(yīng)和傳導(dǎo)
        1.1.3 冷激反應(yīng)的功能
        1.1.4 冷激蛋白Csp的廣泛分布
        1.1.5 冷激蛋白Csp的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
        1.1.6 冷激蛋白Csp的表達(dá)與功能
        1.1.7 細(xì)胞對(duì)冷激反應(yīng)的調(diào)控
        1.1.8 冷激反應(yīng)中的重要功能蛋白
    1.2 耐輻射異常球菌研究進(jìn)展
        1.2.1 耐輻射異常球菌的分離及進(jìn)化地位
        1.2.2 耐輻射異常球菌的特殊結(jié)構(gòu)特征
        1.2.3 耐輻射異常球菌的極端抗性
        1.2.4 耐輻射異常球菌的損傷修復(fù)機(jī)制
        1.2.5 耐輻射異常球菌脅迫應(yīng)答蛋白
        1.2.6 耐輻射細(xì)菌中的冷激蛋白
    1.3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)關(guān)鍵技術(shù)及其在細(xì)菌功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用
        1.3.1 RNA-seq是利用高通量對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測(cè)序分析的技術(shù)
        1.3.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在細(xì)菌冷激反應(yīng)全局調(diào)控研究中的應(yīng)用
    1.4 立題依據(jù)和技術(shù)路線
        1.4.1 立題依據(jù)
        1.4.2 技術(shù)路線
第二章 耐輻射異常球菌冷激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 菌株、質(zhì)粒來(lái)源
        2.1.2 培養(yǎng)基、酶類及生化試劑
        2.1.3 主要儀器設(shè)備和軟件
        2.1.4 培養(yǎng)條件
        2.1.5 生長(zhǎng)柱狀圖的繪制
        2.1.6 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析樣品的RNA制備
        2.1.7 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法
        2.1.8 轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析方法
        2.1.9 實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證
        2.1.10 Western Blot檢測(cè)
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 耐輻射異常球菌的低溫生長(zhǎng)分析
        2.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)耐輻射異常球菌冷激條件下csp的表達(dá)
        2.2.3 Western Blot檢測(cè)耐輻射異常球菌冷激條件下Csp蛋白的表達(dá)
        2.2.4 耐輻射異常球菌冷激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄組概況
        2.2.5 耐輻射異常球菌冷激反應(yīng)時(shí)高表達(dá)的基因
        2.2.6 耐輻射異常球菌冷激反應(yīng)時(shí)表達(dá)上調(diào)的基因
        2.2.7 耐輻射異常球菌冷激反應(yīng)時(shí)表達(dá)下調(diào)的基因
    2.3 討論
        2.3.1 耐輻射異常球菌具有典型的冷激反應(yīng)
        2.3.2 耐輻射異常球菌冷激反應(yīng)關(guān)鍵基因的分析
        2.3.3 耐輻射異常球菌冷激反應(yīng)激活UvrABC途徑
        2.3.4 耐輻射異常球菌冷激反應(yīng)時(shí)維持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)
        2.3.5 耐輻射異常球菌冷激反應(yīng)時(shí)抗氧化酶被激活
        2.3.6 耐輻射異常球菌冷激反應(yīng)過(guò)程
第三章 耐輻射異常球菌突變株△csp及回補(bǔ)株△cspC的表型分析
    3.1 材料與方法
        3.1.1 菌株、質(zhì)粒來(lái)源
        3.1.2 培養(yǎng)基、酶類及生化試劑
        3.1.3 培養(yǎng)條件
        3.1.4 細(xì)菌基因組及質(zhì)粒的提取
        3.1.5 PCR反應(yīng)
        3.1.6 DNA目的片段的切膠回收
        3.1.7 DNA片段的酶切與連接
        3.1.8 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的化學(xué)轉(zhuǎn)化法
        3.1.9 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
        3.1.10過(guò)氧化氫沖擊后存活率的分析
        3.1.11 Western Blot實(shí)驗(yàn)
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 Csp的生物信息學(xué)分析
        3.2.2 耐輻射異常球菌突變株 Δcsp特征及回補(bǔ)株 ΔcspC的構(gòu)建
        3.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)耐輻射異常球菌不同生長(zhǎng)時(shí)期csp的表達(dá)
        3.2.4 Western Blot檢測(cè)耐輻射異常球菌不同生長(zhǎng)時(shí)期Csp蛋白的表達(dá)
        3.2.5 耐輻射異常球菌野生型及其突變株和回補(bǔ)株的生長(zhǎng)曲線分析
        3.2.6 耐輻射異常球菌野生型及其突變株和回補(bǔ)株的過(guò)氧化氫抗性分析 . 563.3 討論
    3.3 討論
        3.3.1 耐輻射異常球菌Csp在穩(wěn)定期的積累
        3.3.2 耐輻射異常球菌冷激蛋白Csp參與穩(wěn)定期脅迫反應(yīng)
        3.3.3 耐輻射異常球菌冷激蛋白Csp參與氧化沖擊的響應(yīng)
        3.3.4 耐輻射異常球菌冷激蛋白Csp參與磷酸戊糖途徑的調(diào)節(jié)
第四章 耐輻射異常球菌Csp介導(dǎo)的冷脅迫調(diào)控機(jī)制
    4.1 材料與方法
        4.1.1 菌株、質(zhì)粒來(lái)源
        4.1.2 培養(yǎng)基、酶類及生化試劑
        4.1.3 培養(yǎng)條件
        4.1.4 PCR反應(yīng)
        4.1.5 蛋白三維結(jié)構(gòu)的模擬
        4.1.6 啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)
        4.1.7 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)代謝途徑的定位
        4.1.8 過(guò)氧化氫酶活性分析
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 耐輻射異常球菌缺失csp對(duì)低溫存活的影響
        4.2.2 耐輻射異常球菌冷激反應(yīng)中冷激蛋白Csp調(diào)控基因的預(yù)測(cè)
        4.2.3 冷脅迫條件下，Csp調(diào)控途徑的預(yù)測(cè)
        4.2.4 冷脅迫條件下，Csp增強(qiáng)麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)
        4.2.5 冷脅迫條件下，Csp增強(qiáng)抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)
        4.2.6 冷脅迫條件下過(guò)氧化氫酶活性的變化
    4.3 討論
        4.3.1 csp缺失對(duì)細(xì)胞低溫存活的影響
        4.3.2 Csp對(duì)麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控作用
        4.3.3 Csp對(duì)AsnC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的調(diào)控作用
        4.3.4 Csp對(duì)過(guò)氧化氫酶基因katA的調(diào)控模型
        4.3.5 Csp對(duì)耐輻射異常球菌冷激反應(yīng)的調(diào)控
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3980965