發(fā)布時間：2020-11-16 23:35

　　 隨著我國人口老齡化程度日趨嚴(yán)重,骨質(zhì)疏松癥已成為我國面臨的重要公共健康問題。目前臨床常用的治療骨質(zhì)疏松癥藥物多為抗骨吸收藥物,促骨形成藥物較少。因此,進一步深入開展骨質(zhì)疏松癥發(fā)生機制的基礎(chǔ)研究,以尋求更多有效的促骨形成藥物,具有非常重要的臨床診療價值。細(xì)胞周期素依賴激酶2相關(guān)性Culin結(jié)構(gòu)域1(CDK2-associated cullin1,CACUL1)是一個與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)的基因,最近研究發(fā)現(xiàn)CACUL1通過抑制成脂標(biāo)志物PPARγ,從而抑制3T3-L1細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)同3T3-L1細(xì)胞一樣,都是脂肪細(xì)胞的前體細(xì)胞,都具有成脂分化的能力。如果CACUL1在BMSCs中也具有相同的抑制成脂分化能力,那么CACUL1即可促進BMSCs向成骨細(xì)胞分化,從而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松癥的作用。因此,本課題從以下三部分內(nèi)容進行研究:(1)利用GEO數(shù)據(jù)庫的基因芯片數(shù)據(jù),分析CACUL1基因在骨質(zhì)疏松癥患者和正常人BMSCs內(nèi)表達上的差異;通過臨床收集骨質(zhì)疏松性骨折患者和正常骨折患者的骨髓組織,驗證CACUL1基因在骨質(zhì)疏松患者BMSCs中表達降低;(2)通過培養(yǎng)大鼠BMSCs,分析成脂、成骨分化過程中CACUL1的表達變化趨勢;構(gòu)建腺病毒過表達及沉默CACUL1載體,研究CACUL1對BMSCs成脂、成骨分化的影響;(3)分析CACUL1在BMSCs成骨分化過程中的作用及分子機制。第一部分CACUL1在骨質(zhì)疏松患者BMSCs中的表達研究目的:通過生物信息學(xué)分析CACUL1在骨質(zhì)疏松癥患者和正常人BMSCs中表達差異,明確CACUL1在骨質(zhì)疏松患者BMSCs中表達降低;通過臨床收集骨質(zhì)疏松性骨折患者和正常骨折患者的骨髓組織,驗證CACUL1基因在骨質(zhì)疏松患者BMSCs中表達降低。方法:GEO數(shù)據(jù)庫檢索并下載基因芯片GSE35958的原始數(shù)據(jù),使用基于R語言的Bioconductor軟件對數(shù)據(jù)進行預(yù)處理及分析,明確CACUL1在骨質(zhì)疏松患者BMSCs中表達降低。根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)招募骨質(zhì)疏松性骨折和正常骨折患者各6人;在骨折復(fù)位手術(shù)中采集擴孔器上殘余的骨髓組織,分離培養(yǎng)BMSCs,使用Western blotting實驗檢測CACUL1蛋白的表達,驗證CACUL1基因在骨質(zhì)疏松患者BMSCs中表達降低。結(jié)果:對基因芯片GSE35958的數(shù)據(jù)進行分析后,共篩選出差異表達基因805個,CACUL1在骨質(zhì)疏松癥患者BMSCs中表達較對照組降低3.5倍。Western Blotting結(jié)果顯示,骨質(zhì)疏松癥患者BMSCs中CACUL1的表達較正常對照組低。結(jié)論:CACUL1在骨質(zhì)疏松癥患者BMSCs中的表達較正常人降低,CACUL1可能在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。第二部分CACUL1對BMSCs成脂、成骨分化的作用研究目的:研究CACUL1基因在大鼠BMSCs成脂和成骨分化早期階段的表達趨勢;利用腺病毒沉默或過表達CACUL1,研究CACUL1對BMSCs成脂和成骨分化的作用。方法:使用經(jīng)典的成脂和成骨誘導(dǎo)方案分別誘導(dǎo)SD大鼠BMSCs,誘導(dǎo)后1d、2d、3d、4d和5d時qRT-PCR和Western blotting方法檢測CACUL1的表達。通過腺病毒載體分別沉默和過表達CACUL1基因,檢測成脂分化的標(biāo)志物PPARγ2、LPL和FABP4以及成骨分化的標(biāo)志物RUNX2、OCN和OPN,明確CACUL1基因?qū)�BMSCs成脂和成骨分化的作用。結(jié)果:CACUL1 mRNA和蛋白表達在成脂誘導(dǎo)分化后5d下降,而在成骨誘導(dǎo)分化后5d顯著增加。沉默CACUL1上調(diào)成脂分化的標(biāo)志物PPARγ2、LPL和FABP4的mRNA和蛋白表達,下調(diào)成骨分化的標(biāo)志物RUNX2、OCN和OPN的mRNA和蛋白表達。過表達CACUL1抑制成脂分化標(biāo)志物的表達,促進成骨分化標(biāo)志物的表達。結(jié)論:CACUL1在BMSCs成脂分化早期表達降低,而在成骨分化早期表達增高;CACUL1能抑制BMSCs成脂分化,促進其成骨分化;CACUL1可能是BMSCs定向分化過程中的關(guān)鍵因子,其促骨形成作用,可能成為治療骨質(zhì)疏松癥的重要潛在靶點。第三部分CACUL1在BMSCs成骨分化過程中的分子機制研究目的:分析CACUL1在BMSCs成骨分化過程中的分子機制。方法:通過腺病毒載體過表達CACUL1,使用Western blotting方法檢測BMSCs成骨分化過程中p-ERK1/2及ERK1/2的表達;應(yīng)用ERK1/2通路特異性抑制劑U0126后,Western blotting方法檢測成骨分化的標(biāo)志物RUNX2的表達。結(jié)果:腺病毒過表達CACUL1后,RUNX2蛋白表達升高,同時p-ERK1/2的表達也升高,而EKR1/2的表達不變。使用抑制劑U0126后,p-ERK1/2的表達降低,而成骨標(biāo)志基因RUNX2也顯著降低。結(jié)論:CACUL1通過激活ERK1/2信號通路促進BMSCs向成骨細(xì)胞分化,促進骨質(zhì)形成;由于CACUL1的促成骨作用,可能成為治療骨質(zhì)疏松癥藥物的潛在靶點。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

基因芯片讀取后,對所有基因的表達值取log2,可見各樣本之間基因表達量不一(圖1A)。通過參照管家基因?qū)λ�有�?shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化校正,如圖1B所示。2.2 CACUL1 基因在骨質(zhì)疏松患者BMSCs中表達降低

使用limma包對基因芯片數(shù)據(jù)分析后,篩選出差異表達基因805個,其中骨質(zhì)疏松患者表達上調(diào)的基因443個,表達下調(diào)的基因362個。骨質(zhì)疏松組與對照組BMSCs中所有差異基因的表達見圖2A。從篩選出的差異表達基因中查詢CACUL1的表達水平,結(jié)果顯示CACUL1在骨質(zhì)疏松癥患者BMSCs中表達較對照組降低3.5倍(logFC=-3.50177385,t=-4.75636821,P=0.000784128,adj.P.Val=0.05843856)。3 討論

采用全骨髓貼培養(yǎng)法提取人BMSCs,48 h后顯微鏡下觀察,培養(yǎng)瓶底部可見貼壁細(xì)胞,形態(tài)各異,有圓形、梭形和多角形;貼壁細(xì)胞多成集落分布,集落中心位置細(xì)胞較密;還可見大量不貼壁的懸浮細(xì)胞(圖3A)。換液處理去除懸浮庫細(xì)胞,通過多次換液傳代,雜細(xì)胞數(shù)量減少,逐漸純化為單一的BMSCs;P3代BMSCs形態(tài)為梭形,細(xì)胞之間呈放射狀或典型的旋渦狀排列(圖3B)。2.2 人BMSCs的流式鑒定
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1 孔鶯;亓小改;白沛松;南克俊;;細(xì)胞周期相關(guān)新基因CACUL1對培養(yǎng)的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2013年05期

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1 趙恩哲;CACUL1調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂與成骨分化的分子機制研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2020年

本文編號：2886793