隨著全球經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,化石資源迅速地被消耗,能源、資源、環(huán)境問題已經(jīng)成為制約人類社會(huì)經(jīng)濟(jì)和生態(tài)可持續(xù)發(fā)展的主要瓶頸。纖維素是植物細(xì)胞壁的主要組成成分,是地球上最豐富的可再生碳源。纖維素的充分利用能夠以可持續(xù)的方式緩解化石能源過度利用帶來的環(huán)境危機(jī)。但是由于纖維素生物降解的生產(chǎn)成本過高,限制了資源的有效利用。為有效利用纖維素資源,構(gòu)建高效纖維素降解酶系一直為研究的重點(diǎn)。目前普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為纖維素酶系構(gòu)成應(yīng)主要由糖苷水解酶系、氧化酶系及輔助降解因子等組成。相對(duì)于外切纖維素酶及p-葡萄糖苷酶較為清晰的功能定位,酶系中往往存在多種內(nèi)切纖維素酶,其功能與作用模式并沒有得到很好的區(qū)分。同時(shí),由于纖維素酶活測(cè)定使用底物衍生物和類似物并不能夠全面反映酶系的活力,更不能確切反映纖維素酶系中各組分的角色與功能。因此,本文針對(duì)以上問題進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究,取得主要研究結(jié)果如下：1、通過對(duì)瑞氏木霉在14種不同碳源上糖苷水解酶的動(dòng)態(tài)表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)瑞氏木霉纖維素酶系不同組分的表達(dá)分泌具有底物差異性。說明不同內(nèi)切纖維素酶組分具有生理功能的差異性。對(duì)瑞氏木霉進(jìn)行不同碳源下的分批培養(yǎng),測(cè)定了其胞外外切纖維素酶、內(nèi)切纖維素酶和...

【文章頁數(shù)】：119 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第1章 緒論
    1.1 木質(zhì)纖維素
        1.1.1 纖維素
        1.1.2 半纖維素
        1.1.3 木質(zhì)素
    1.2 降解木質(zhì)纖維素的真菌
    1.3 瑞氏木霉(Trichoderma reesei)的纖維素酶系
        1.3.1 纖維素酶的種類
        1.3.2 不同酶組分之間的協(xié)同作用
        1.3.3 一種新的纖維素轉(zhuǎn)化策略
    1.4 測(cè)定纖維素酶活的底物
        1.4.1 可溶性底物
        1.4.2 不溶性底物
    1.5 纖維素酶活性測(cè)定
        1.5.1 內(nèi)切纖維素酶活性的測(cè)定
        1.5.2 外切纖維素酶活性的測(cè)定
        1.5.3 β-D-葡萄糖苷酶活性的測(cè)定
        1.5.4 總纖維素酶活的測(cè)定
    1.6 T. reesei的系統(tǒng)生物學(xué)研究
        1.6.1 T. reesei纖維素酶和半纖維素酶的基因組研究
        1.6.2 T. reesei基因組碳水化合物水解酶的分布
        1.6.3 T. reesei突變株基因組測(cè)序以確定影響纖維素酶生產(chǎn)的菌株
        1.6.4 T. reesei的轉(zhuǎn)錄組研究
        1.6.5 T. reesei的分泌組研究
        1.6.6 T. reesei的代謝組學(xué)研究
    1.7 立題依據(jù)
第2章 不同碳源下T. reesei胞外糖苷水解酶的分析研究
    2.1 材料與方法
        2.1.1 菌種
        2.1.2 培養(yǎng)基及試劑
        2.1.3 儀器與設(shè)備
        2.1.4 粗酶液的提取
        2.1.5 糖苷水解酶活性的測(cè)定
        2.1.6 糖苷水解酶譜及寡糖譜分析
        2.1.7 T. reesei功能蛋白質(zhì)組學(xué)分析
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 不同碳源發(fā)酵粗酶液中還原糖測(cè)定以及寡糖譜分析
        2.2.2 T. reesei胞外糖苷水解酶活性的測(cè)定及動(dòng)態(tài)酶譜分析
        2.2.3 T. reesei在不同的碳源上其功能蛋白組學(xué)分析
    2.3 小結(jié)與討論
第3章 熒光輔助糖電泳技術(shù)與纖維素酶降解模式的分析
    3.1 材料與方法
        3.1.1 化學(xué)試劑
        3.1.2 再生無定形纖維素(RAC)底物的制備
        3.1.3 T. reesei的內(nèi)切纖維素酶TrCel12A的異源表達(dá)
        3.1.4 內(nèi)切纖維素酶ChCel5A的表達(dá)純化
        3.1.5 T. reesei外切纖維素酶Ⅰ(TrCel7A)的純化
        3.1.6 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
        3.1.7 酶解實(shí)驗(yàn)測(cè)定
        3.1.8 樣品熒光標(biāo)記
        3.1.9 電泳條件優(yōu)化
        3.1.10 電泳數(shù)據(jù)定量提取
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 TrCel12A的異源表達(dá)
        3.2.2 ChCel5A的純化
        3.2.3 TrCel7A的純化
        3.2.4 利用FACE測(cè)定纖維寡糖的濃度
        3.2.5 利用FACE分析產(chǎn)物譜快速確定纖維素酶的種類
        3.2.6 利用時(shí)間過程的產(chǎn)物譜分析區(qū)分內(nèi)切纖維素酶的降解模式
    3.3 小結(jié)與討論
第4章 T.reesei不同內(nèi)切纖維素酶不同降解機(jī)制的研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 菌株與質(zhì)粒
        4.1.2 培養(yǎng)基及相關(guān)試劑
        4.1.3 菌種活化與培養(yǎng)
        4.1.4 T. reesei RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
        4.1.5 內(nèi)切纖維素酶基因克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.1.6 EG Ⅰ的異源表達(dá)
        4.1.7 EG Ⅱ、EGⅣ的異源表達(dá)
        4.1.8 不同家族內(nèi)切纖維素酶水解RAC與寡糖的FACE檢測(cè)
        4.1.9 不同家族內(nèi)切纖維素酶的生物信息學(xué)分析
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 內(nèi)切纖維素酶基因的擴(kuò)增
        4.2.2 內(nèi)切纖維素酶的表達(dá)純化
        4.2.3 內(nèi)切纖維素酶水解RAC產(chǎn)物譜的FACE檢測(cè)
        4.2.4 內(nèi)切纖維素酶水解寡糖產(chǎn)物譜的FACE檢測(cè)
        4.2.5 內(nèi)切纖維素酶活性中心的結(jié)構(gòu)與表面電勢(shì)分析
        4.2.6 內(nèi)切纖維素酶活性部位與糖環(huán)的相互作用分析
        4.2.7 內(nèi)切纖維素酶結(jié)合寡糖的分子動(dòng)力學(xué)模擬
    4.3 小結(jié)與討論
第5章 熒光光譜測(cè)定纖維素酶與底物的結(jié)合能力
    5.1 材料與方法
        5.1.1 試劑
        5.1.2 主要儀器設(shè)備
        5.1.2 內(nèi)切纖維素酶ChCel5A的表達(dá)純化
        5.1.3 T. reesei外切纖維素酶Ⅰ(TrCel7A)的純化
        5.1.4 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
        5.1.5 纖維素酶活性的測(cè)定
        5.1.6 熒光體熒光光譜的測(cè)定
        5.1.7 熒光體與pNP類底物結(jié)合的熒光光譜測(cè)定
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 熒光體自身熒光光譜的測(cè)定
        5.2.2 熒光光譜的淬滅與結(jié)合常數(shù)及結(jié)合能的計(jì)算
        5.2.3 使用熒光光譜的方法計(jì)算纖維素酶與底的結(jié)合常數(shù)以及結(jié)合自由能
    5.3 小結(jié)與討論
全文總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝
附件



本文編號(hào)：3995326