發(fā)布時間：2020-11-21 23:26

　　 高血壓是導(dǎo)致冠心病、外周動脈疾病、中風(fēng)等一系列心腦血管疾病的主要風(fēng)險因子[1]。2014年全球成人高血壓發(fā)病率已達到22%，如何有效降低血壓現(xiàn)已成為當(dāng)前研究的焦點問題。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE，EC3.4.15.1）在調(diào)節(jié)機體血壓和心血管功能方面起著重要作用，而有效抑制ACE活性已成為當(dāng)前緩解和治療高血壓的一線策略之一。由于大部分化學(xué)合成或修飾的ACE抑制劑存在著潛在的腎功能損害、干咳、皮疹、高鉀血癥、血管神經(jīng)性水腫等副作用，因此對它們的使用應(yīng)十分謹慎；而源自天然食物蛋白的ACE抑制活性肽的作用效果溫和、安全，因而漸漸受到人們的重視。牛血作為肉牛屠宰加工的主要副產(chǎn)物，因其腥味較重、口感不佳、保存困難等缺點，迄今仍未得到有效開發(fā)利用。但是牛血中富含血紅蛋白，是制取ACE抑制活性肽的優(yōu)良資源，因此，具有極大的開發(fā)潛能。當(dāng)前，采用傳統(tǒng)的水解-分離-純化方法制備ACE抑制活性肽已成體系，但該方法卻存在著耗資較大、周期較長等問題。為了應(yīng)對這一挑戰(zhàn)，計算機模擬技術(shù)已逐漸應(yīng)用于ACE抑制活性肽的開發(fā)及ACE抑制分子機制的研究。 本研究以牛血紅蛋白為原料，采用傳統(tǒng)方法和計算機輔助建模方法對牛血紅蛋白序列中封存的ACE抑制活性肽進行序列鑒定和預(yù)測，探討了ACE抑制活性肽降解小肽及其協(xié)同作用對ACE抑制活性的影響，并通過分子對接技術(shù)研究牛血紅蛋白源ACE抑制活性肽與ACE分子之間的相互作用，探索活性肽的ACE抑制分子機制。 首先，采用體外模擬胃腸道消化水解、超濾、凝膠柱層析分離純化獲得了高活力的ACE抑制活性肽組分，通過高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜鑒定得到了7條活性肽序列，其中Phe-Leu和Thr-Tyr具有較好的ACE抑制活性，IC50分別為290.66μM和96.43μM，其余5條二肽IC50均在1000μM以上。構(gòu)效關(guān)系分析表明活性肽兩端的氨基酸殘基對其ACE抑制能力有著重要作用，C端含有芳環(huán)/雜環(huán)類氨基酸殘基、疏水性氨基酸殘基和/或N端含有疏水性氨基酸殘基均能提高活性肽的ACE抑制能力。分子對接結(jié)果表明Phe-Leu和Thr-Tyr主要通過氫鍵、疏水相互作用等非共價分子間作用來維持活性肽-ACE體系穩(wěn)定。 為提高獲取牛血紅蛋白ACE抑制活性肽序列的效率，本研究采用計算機輔助建模技術(shù)進行活性肽序列預(yù)測。利用Peptide Cutter模擬pH值為1.3條件下胃蛋白酶水解牛血紅蛋白的過程，建立牛血紅蛋白虛擬水解2~5肽庫，同時采用藥效團模型技術(shù)建立了基于21條ACE抑制活性肽化學(xué)結(jié)構(gòu)與空間特征的ACE抑制活性肽預(yù)測模型，并對牛血紅蛋白虛擬水解2~5肽庫進行篩選，獲得了Ala-Ser-His-Leu和Try-Thr-Gln-Arg-Phe兩條肽序列，其實驗IC50分別為3.13mM和42.82μM。分子對接結(jié)果表明兩條肽均滿足非競爭性抑制模式特征。 為提高計算機輔助建模預(yù)測的準確性，采用三層誤差反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型建立了一個基于24條ACE抑制活性五肽結(jié)構(gòu)、空間、熱力學(xué)和電子特征的預(yù)測模型，同時利用Peptide Cutter的模擬胃蛋白酶（pH1.3、pH2）和胰蛋白酶水解牛血紅蛋白的過程，并建立了牛血紅蛋白虛擬水解五肽庫。結(jié)果表明Try-Thr-Gln-Arg-Phe具有最高的預(yù)測活性序列。由于該五肽序列同時被兩個預(yù)測模型篩選出來，本研究采用了柔性對接方式對其ACE抑制分子機制進行進一步分析，發(fā)現(xiàn)活性肽谷氨酰胺殘基親水側(cè)鏈上的羰基氧與Zn2+之間產(chǎn)生的配位作用可能是該五肽發(fā)揮ACE抑制作用的關(guān)鍵。 最后，本論文研究了Try-Thr-Gln-Arg-Phe的降解行為對ACE抑制活力的影響以及該五肽的降解小肽之間的ACE抑制協(xié)同作用。發(fā)現(xiàn)降解小肽中的Thr-Gln-Arg和Try-Thr保持了較高的ACE抑制活力，并且降解小肽Thr-Gln和Gln-Arg，Try-Thr-Gln和Arg-Phe之間存在顯著的正協(xié)同作用。分子對接結(jié)果表明降解小肽之間的ACE抑制正協(xié)同作用更傾向于在兩條活性肽分別滿足不同ACE抑制模式特征的組合中發(fā)生。 本研究為進一步闡明生物活性肽的ACE抑制分子機制做出了一定貢獻，具有重要的現(xiàn)實意義和理論意義。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：Q51;TQ464.7
【部分圖文】：

吉林大學(xué)博士學(xué)位論文（Bradykinin，BK，Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg），賴氨酰緩 Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg ） 和 甲 硫 氨 酰 - 賴 氨 酰 緩 激Met-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro -Phe-Arg）三種。三者中，BK 表現(xiàn)出降壓活性，一方面，它可以直接作用于緩激肽 B2受體，促進血管舒張，降；另一方面，它與可以促進前列腺素合成，前列腺素能使血管平滑肌松弛外周血管阻力，從而有效降低血壓。ACE 作為激肽酶之一（激肽酶 II），能 降解為無活性的片段，使之無法發(fā)揮降壓作用。圖 1.1[11]展示了ACE 在 RAS 中調(diào)節(jié)機體血壓的機制。綜上所述，有效的抑制 ACE 活性，是調(diào)節(jié)血壓的關(guān)鍵所在。

含有一個與 sACE 的 C 端結(jié)構(gòu)域高度一致的同源結(jié)構(gòu)域；tACE 從第 73 個堿基開始，其序列與 sACE 的 C 端完全相同。ACE 的 C 結(jié)構(gòu)域包含一個保守的鋅結(jié)合模體HEXXH，該結(jié)構(gòu)域也已被證實為ACE調(diào)控血壓和心血管功能的主導(dǎo)性位點[17, 18]。1.1.4 ACE 的三維結(jié)構(gòu)特征糖構(gòu)型在蛋白質(zhì)表面的靈活性和異質(zhì)性是導(dǎo)致蛋白糖基化，進而阻礙蛋白質(zhì)晶體生成的主要因素[18]。ACE蛋白質(zhì)表面具有16個潛在N-糖基化位點，其晶體生長極為困難，這導(dǎo)致 ACE 的 C 結(jié)構(gòu)域（PDB ID：1O86）和 N 結(jié)構(gòu)域（PDB ID：2C6N）三維結(jié)構(gòu)直到 2003 年之后才被 Natesh[19]和 Corradi[12]等人陸續(xù)解出。ACE的 C 結(jié)構(gòu)域和 N 結(jié)構(gòu)域具有約 60%的序列一致性，它們的晶體結(jié)構(gòu)也展示出二者在結(jié)構(gòu)上的高度同源性（圖 1.2）。

圖 1.3 ACE 活性中心假定工作模型[10]Figure 1.3 Hypothetical working model of ACE active centerCE 的催化活性中心位于其 Zn2+附近，在 C 結(jié)構(gòu)域中，Zn2+與 His 38 Glu 411 通過配位鍵形成較穩(wěn)定的四面體結(jié)構(gòu)；在 N 結(jié)構(gòu)域中，Zn2+His 365 和 Glu 389 通過配位鍵形成較穩(wěn)定的四面體結(jié)構(gòu)。小分子可分子內(nèi)部的疏水空腔進入其活性中心，通過與 ACE 活性中心氨基酸殘鍵、范德華力、靜電力、親/疏水作用以及與 Zn2+之間的配位作用等變ACE活性構(gòu)象，從而調(diào)節(jié) ACE的催化活性。Ondetti 和Cushman 等研究了小分子抑制劑對 ACE 活性中心的調(diào)節(jié)機制，發(fā)現(xiàn) ACE 活性于其 S1'和 S1 亞位點（活性口袋）之間狹窄的通道中，而保守的鋅結(jié)XH 的穩(wěn)定是維持 ACE 活性的關(guān)鍵因素。他們認為 ACE 催化活性中心
【參考文獻】

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1 張婷;莊紅;薛培宇;劉靜波;;血紅素鐵功能及其二價鐵保護探索[J];肉類研究;2008年03期

本文編號：2893755