發(fā)布時間：2020-11-18 03:42

　　 為了研究河南華溪蟹(Sinopotamon henanense)特異性結(jié)合鎘離子(Cadmium,Cd~(2+))的MT亞型(Cd~(2+)specific binding metallothioneins of S.henanense,ShCdMT)、特異性結(jié)合銅離子(Copper,Cu~(2+))的MT亞型(Cu~(2+)specific binding metallothioneins of S.henanense,ShCuMT)的金屬結(jié)合特性,本學(xué)位論文首先設(shè)計了大腸桿菌(Escherichia coli)菌體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn),研究了含有ShCdMT重組菌體的金屬耐受性、斑點(diǎn)生長情況以及對培養(yǎng)基中重金屬離子的清除效果;采用圓二色(Circular dichroism,CD)光譜掃描、等溫滴定微量熱(Isothermal titration calorimetry,ITC)變化實(shí)驗(yàn)方法,研究了ShCdMT的金屬結(jié)合特性。其次,為了進(jìn)一步了解河南華溪蟹ShCdMT的金屬結(jié)合能力,綜合利用電噴霧飛行質(zhì)譜(Electrospray ionization mass spectrometry with a time-of-flight analyser,ESI-TOF-MS)、電感耦合等離子體質(zhì)譜(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)、CD掃描和ITC熱變化實(shí)驗(yàn)技術(shù)與手段,分析了Cd-、Cu-、鉛(Lead,Pb~(2+))-和鋅(Zinc,Zn~(2+))-ShCdMT的金屬結(jié)合化學(xué)計量數(shù)、Zn-ShCdMT與Cd~(2+)、Cu~(2+)和Pb~(2+)的體外交換反應(yīng)。還有,為了獲得ShCuMT蛋白,在克隆得到了shCumt基因cDNA全長之后,利用DNAMAN、MEGA7.0、Bioedit軟件,分析了shCumt的核酸和ShCuMT蛋白氨基酸序列、進(jìn)化樹構(gòu)建并進(jìn)行了蛋白質(zhì)多重序列比對;利用EXPASY在線Protparam和SOPMA軟件,解析了ShCuMT蛋白的理化性質(zhì)和二級結(jié)構(gòu)元件,構(gòu)建了pET-28a-SUMO-shCumt原核表達(dá)載體;利用Ni-NTA親和層析和凝膠層析,純化得到了ShCuMT蛋白。最后,為了研究ShCuMT的金屬結(jié)合特性,利用Cd-、Cu-、和Zn-ShCuMT與DTNB的反應(yīng)、CD光譜掃描、ITC熱變化和ESI-TOF-MS實(shí)驗(yàn)方法手段,研究了ShCuMT的金屬結(jié)合特性。結(jié)果包括四個方面:1.河南華溪蟹ShCdMT的金屬結(jié)合特性與對照組相比,含有ShCdMT的重組菌體對Cd~(2+)、Cu~(2+)、Pb~(2+)和Zn~(2+)具有一定的耐受性,對培養(yǎng)基中Cd~(2+)和Pb~(2+)的清除作用呈顯著或極顯著性降低(P0.05,P0.01)。在大腸桿菌體內(nèi)合成的Cd-ShCdMT具有致密且穩(wěn)定的三維折疊結(jié)構(gòu),在體外,ShCdMT能螯合6個Cd~(2+)、7個Cu~(2+)、6個Pb~(2+)。ShCdMT對金屬離子結(jié)合的穩(wěn)定性從高到低的順序是:Cu-Cd-Pb-Zn-ShCdMT。2.河南華溪蟹ShCdMT與不同金屬離子的結(jié)合能力在大腸桿菌體內(nèi)合成的Zn-、Cd-和Pb-ShCdMT復(fù)合物的主要組份是:Zn_(15)-ShCdMT、Cd_9-ShCdMT和Pb_5-ShCdMT;Zn-ShCdMT中的Zn~(2+)極易被Cd~(2+)、Cu~(2+)、Pb~(2+)取代,分別形成穩(wěn)定的Cd-S鍵、Cu-S鍵和Pb-S鍵。Zn-ShCdMT具有與apo-ShCdMT一樣的金屬結(jié)合化學(xué)計量數(shù),能配位6個Cd~(2+)、7個Cu~(2+)和6個Pb~(2+);當(dāng)與Zn-ShCdMT發(fā)生交換的Cd~(2+)、Cu~(2+)和Pb~(2+)的數(shù)量分別超過6個、7個和6個時,形成的Cd-S鍵、Cu-S鍵和Pb-S鍵的幾何結(jié)構(gòu)將發(fā)生改變。3.河南華溪蟹shCumt基因的cDNA克隆、生物信息學(xué)分析和ShCuMT蛋白的原核表達(dá)shCumt基因cDNA全長為198bp,shCumt基因cDNA的核酸序列與相近物種的mt核酸序列具有較高的相似性;ShCuMT蛋白含有65個氨基酸,其中,半胱氨酸(Cysteine,Cys)含量有21個,約占總氨基酸含量的32.3%,含有3個CXC保守基序、2個CCC串聯(lián)基序、1個CX_5CXC基序、1個CX_3CXC基序和1個CXCX_2C基序,但不含任何芳香族氨基酸。有較高含量的甘氨酸(Glycine,Gly)、賴氨酸(Lysine,Lys)和絲氨酸(Serine,Ser)等小分子量氨基酸,理論分子量約為6293 Da、等電點(diǎn)8.3,ShCuMT蛋白幾乎不含有任何二級結(jié)構(gòu)元件,無規(guī)則卷曲的比例占87.69%,ShCuMT蛋白中氨基酸序列與相近物種的特異性結(jié)合Cu~(2+)的MT亞型(Cu~(2+)specific binding metallothioneins,Cu-MT)或者M(jìn)T具有較高的相似性,是一種典型的Cu-硫醇(Cu-thioneins)MT蛋白;誘導(dǎo)SUMO-ShCuMT原核表達(dá)的最佳IPTG濃度是1mM,誘導(dǎo)表達(dá)的最佳時間為8 h,經(jīng)純化、酶切獲得了較純的ShCuMT蛋白。4.河南華溪蟹ShCuMT的金屬結(jié)合特性ShCuMT表現(xiàn)了較強(qiáng)的金屬離子結(jié)合特性,ShCuMT與Cd~(2+)、Zn~(2+)和Cu~(2+)結(jié)合的穩(wěn)定性由高到低的順序?yàn)?Cu~(2+)Cd~(2+)Zn~(2+)。在酸性條件下,ShCuMT結(jié)合Cu~(2+)具有穩(wěn)定性和唯一性;在大腸桿菌體內(nèi)合成的Cd-、Cu-和Zn-ShCuMT中的主要組份分別為:Cd_(19)-、Zn_(19)-和Cu_(32)-ShCuMT。體外apo-ShCuMT能夠配位6個Cd~(2+)、3個Zn~(2+)和10個Cu~(2+)。在大腸桿菌體內(nèi)合成的Cd-和Zn-ShCuMT的CD光譜分別在250nm和254 nm處出現(xiàn)了一條高斯(Gaussian)帶,Cu-ShCuMT在270 nm處呈現(xiàn)激聯(lián)耦合條帶,在300-320 nm處呈示典型的Cu-thionein特征性吸收條帶。綜上所述,得出全文結(jié)論如下:一是,ShCdMT對Cd~(2+)的結(jié)合具有偏好性,屬于Cd-Specific MT亞型,具有無脊椎動物MT典型的β/β結(jié)構(gòu)域,能夠與二價金屬離子形成M_6~Ⅱ-ShCdMT配位模式,對一價金屬離子具有較高的親密性,在生物體內(nèi),ShCdMT具有解除Cd~(2+)的毒性和維持Zn~(2+)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的生物學(xué)功能作用。二是,體內(nèi)合成的ShCdMT具有較強(qiáng)的Zn~(2+)積累和Cd~(2+)吸收能力,與apo-ShCdMT類似,Zn-ShCdMT與Cd~(2+)和Pb~(2+)能夠形成M_6~Ⅱ-ShCdMT配位模式,與Cu~(2+)形成M_7~Ⅰ-ShCdMT配位模式。在體內(nèi),Zn-ShCdMT能夠釋放Zn~(2+),吸收Cd~(2+)、Cu~(2+)和Pb~(2+),表明Zn-ShCdMT可以介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Zn~(2+)的轉(zhuǎn)運(yùn)和解除異質(zhì)金屬離子的毒性作用。三是,shCumt基因cDNA全長為198bp,編碼65個氨基酸,Cys含量占32.3%,理論分子量為6293 Da。與其他MT亞型相似,ShCuMT幾乎不含任何二級結(jié)構(gòu)元件,等電點(diǎn)呈堿性,氨基酸序列與藍(lán)蟹(Callinectes sapidus)等近源物種具有較高的相似性,進(jìn)化樹推測,ShCuMT是一種典型的Cu-Specific MT亞型。四是,ShCuMT與Cu~(2+)結(jié)合能夠形成折疊致密、穩(wěn)定的三維空間結(jié)構(gòu)。與Cu~(2+)的結(jié)合具有穩(wěn)定性、唯一性和高化學(xué)計量數(shù),是一種典型的特異性結(jié)合Cu~(2+)的MT亞型。雖然ShCuMT表現(xiàn)出較強(qiáng)的金屬離子結(jié)合特性,但是,當(dāng)異質(zhì)金屬離子入侵時,ShCuMT可能不會表現(xiàn)出解除異質(zhì)金屬離子毒性的作用,而是專一性地發(fā)揮維持Cu~(2+)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用,從而保證河南華溪蟹體內(nèi)呼吸色素血藍(lán)蛋白的正常合成。
【學(xué)位單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：X174
【部分圖文】：

河南華溪蟹ShCdMT和ShCuMT的金屬結(jié)合特性與機(jī)理研究222.2異源表達(dá)ShCdMT的大腸桿菌對Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+的耐受性2.2.1在Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+的培養(yǎng)基中，含ShCdMT的大腸桿菌的生長圖2.2是異源表達(dá)ShCdMT的大腸桿菌對Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+抵抗性的斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，由圖可知，在空白組中，在10-3、10-4、10-5和10-6稀釋度下，對照組與含有ShCdMT的實(shí)驗(yàn)組中大腸桿菌的菌斑大孝致密度、邊緣光滑程度等均相近（圖2.2a）；在Cd2+處理組，對照組菌株能夠生長至10-4稀釋度，然而，實(shí)驗(yàn)組菌株能夠生長至10-6稀釋度，且與對照組相比，菌斑較大、致密度較高、邊緣較圓滑（圖2.2b）；在Cu2+處理組，對照組與實(shí)驗(yàn)組菌株均能生長至10-6稀釋度，但是，實(shí)驗(yàn)組菌斑的生長狀態(tài)較佳（圖2.2c）；在Pb2+和Zn2+處理組，對照組與實(shí)驗(yàn)組菌株生長趨勢與Cu2+接近（圖2.2d-e），對照組與實(shí)驗(yàn)組菌株均能生長至10-6稀釋度，但是，對于10-6稀釋度菌液，實(shí)驗(yàn)組菌斑較對照組生長較好；說明含有ShCdMT的大腸桿菌對Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+均具有抵抗力，這可能是因?yàn)樵诖竽c桿菌體內(nèi)的ShCdMT能夠結(jié)合Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+，從而，增強(qiáng)了菌體對重金屬離子的抵抗能力，然而，與對照組相比，含有ShCdMT大腸桿菌對Cd2+具有較強(qiáng)的抵抗性。圖2.2在不同金屬離子的培養(yǎng)基中空白組和含ShCdMT大腸桿菌的生長狀況(a:空白組；b、c、d和e:在Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+的培養(yǎng)中，對照組和含ShCdMT大腸桿菌的生長狀況)Fig.2.2GrowthpatternsofE.coliheterologouslyexpressedandnotexpressedShCdMTtodifferentkindsofmetalions.(a:withoutmetalionsinthemedium.b,c,dande：thegrowthpatternso

第二章河南華溪蟹ShCdMT的金屬結(jié)合特性研究232.2.2含ShCdMT的大腸桿菌對Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+的耐受性圖2.3是異源表達(dá)ShCdMT大腸桿菌對Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+的耐受性實(shí)驗(yàn)，由圖可知，與對照組相比，在0.1mMCd2+和0.5mMPb2+處理組中，異源表達(dá)ShCdMT的大腸桿菌的生長較佳（圖2.3a和c），然而，在0.3mMCu2+和0.8mMZn2+處理組中，對照組與實(shí)驗(yàn)組的生長曲線接近（圖2.3b和d），說明異源表達(dá)ShCdMT的大腸桿菌對Cd2+和Pb2+具有較強(qiáng)的耐受性，對Cu2+和Zn2+的耐受性不明顯。圖2.3在Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+的暴露下對照組和異源表達(dá)ShCdMT大腸桿菌的生長曲線(a、b、c和d:對照組和異源表達(dá)ShCdMT大腸桿菌在Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+暴露下的生長曲線)Fig.2.3ThegrowthcurvesofE.coliheterologouslyexpressedShCdMTwithCd2+,Cu2+,Pb2+andZn2+.(a:thetoleranceofE.coliheterologouslyexpressedShCdMTofCd2+;b,candd:thetoleranceofE.coliheterologouslyexpressedShCdMTtotheCu2+,Pb2+andZn2+.)2.2.3含ShCdMT的大腸桿菌對培養(yǎng)基中Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+的清除作用圖2.4是異源表達(dá)ShCdMT大腸桿菌對培養(yǎng)基中Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+的清除作用，在0.1mMCd2+和0.5mMPb2+處理組中，在IPTG誘導(dǎo)0h和8h之后，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中Cd2+和Pb2+的濃度呈顯著和極顯著性降低（P<0.05;P<0.01）；在Cu2+和Zn2+處理組，與對照相比，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中Cu2+和Zn2+濃度無顯著性變化，說明ShCdMT對培養(yǎng)基中Cd2+和Pb2+具有較高的清除作用。

河南華溪蟹ShCdMT和ShCuMT的金屬結(jié)合特性與機(jī)理研究24由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出：在大腸桿菌體內(nèi)，ShCdMT能夠結(jié)合Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+，但是，其對不同金屬離子的結(jié)合具有差異性，ShCdMT具有較強(qiáng)的Cd2+和Pb2+結(jié)合能力。圖2.4對照組和異源表達(dá)ShCdMT大腸桿菌對培養(yǎng)基中Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+的清除作用(T0和T8分別是指在培養(yǎng)基中添加Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+后，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的0h和8h。)Fig.2.4ChangesofmetalionconcentrationsinculturemediaofthecontrolandheterologouslyexpressedShCdMTatT0andT8.(T0andT8respectivelyrefertothe0hand8htimepointsafteraddingmetalandIPTG.)2.3體外重構(gòu)的Cd-、Cu-、Pb-與Zn-ShCdMT的金屬結(jié)合特性2.3.1體外重構(gòu)Cd-、Cu-、Pb-和Zn-ShCdMT的光譜學(xué)特性利用UV和CD光譜表征了體外重構(gòu)的Cd-、Cu-、Pb-和Zn-ShCdMT的金屬-配體電荷轉(zhuǎn)移特異性紫外吸收帶[11]，從而，分析ShCdMT在體外與金屬離子的結(jié)合特性（圖2.5）。由圖2.5可知，體外重構(gòu)的Cd-、Cu-、Pb-和Zn-ShCdMT的UV吸收光譜顯示：在254nm處，Cd-ShCdMT顯示一個特征性的吸收峰，這一結(jié)果與其他物種MT與Cd2+結(jié)合后展示的UV特征吸收峰一致（圖2.5a）；在250-280nm之間，重構(gòu)的Cu-ShCdMT展示吸光度的增加，但是，沒有顯著的肩峰出現(xiàn)（圖2.5b）；在250nm和340nm處，重構(gòu)的Pb-ShCdMT展示兩處特征性吸收峰（圖2.5c）；然而，在220nm處，重構(gòu)的Zn-ShCdMT的吸光度顯示微弱的增加（圖2.5d）；CD光譜顯示：在260nm處，重構(gòu)的Cd-ShCdMT呈現(xiàn)密度較高的Gaussian帶[16]（圖2.5e），在250nm處，重構(gòu)的Cu-ShCdMT展示一個密度較低的Gaussian帶（圖2.5f），同時，在250nm處，重構(gòu)的Pb-ShCdMT出現(xiàn)一條明顯的高斯帶（圖2.5g），3
【參考文獻(xiàn)】

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1 武陽;馬文麗;王蘭;;華溪蟹主要組織蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)體系的建立[J];山西大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2011年S2期

2 劉發(fā)義,梁德海,孫鳳,李荷芳,蘭信;餌料中的銅對中國對蝦的影響[J];海洋與湖沼;1990年05期

本文編號：2888286