發(fā)布時間：2020-11-17 16:30

【摘要】：蛋白質(zhì)的折疊復性和分離純化是生產(chǎn)基因重組藥物和高附加值基因產(chǎn)品的關鍵步驟。本文針對蛋白質(zhì)復性過程的兩個關鍵因素(促進二硫鍵形成和抑制蛋白質(zhì)聚集),開展蛋白質(zhì)復性助劑的研究和蛋白質(zhì)復性與集成純化方法的研發(fā)。針對二硫鍵形成問題,從模擬蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)的疏水區(qū)域和正電區(qū)域出發(fā),設計得到模擬寡肽RKCGCFF。研究表明,與傳統(tǒng)氧化劑GSSG和短肽RKCGC相比,RKCGCFF能夠更好地提高變性還原溶菌酶氧化復性的速率和收率,且對較高濃度的溶菌酶也具有較好的輔助復性的效果。分析認為,由于RKCGCFF分子中同時引入了疏水區(qū)域和正電區(qū)域,使其在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上都更加接近于PDI,因此使其在促進二硫鍵形成的同時,又具有一定的抑制蛋白質(zhì)聚集的效果,亦即類似于PDI的分子伴侶功能。針對蛋白質(zhì)聚集問題,基于前人研究發(fā)現(xiàn)的同電荷微球能夠有效抑制蛋白質(zhì)聚集,且其效果與介質(zhì)的電荷密度正相關的結(jié)論,本研究在二氧化硅納米粒子(SNPs)表面接枝聚乙烯亞胺分子(PEI)并二次修飾2-二乙氨基氯乙基(DEAE),得到一系列高電荷密度以及高比表面積的陽離子納米顆粒。利用它們輔助帶正電荷的溶菌酶的氧化復性的研究表明,高電荷密度的納米粒子能夠在極低的介質(zhì)添加量時高效輔助同電荷溶菌酶的復性。與PGMA微米球相比,介質(zhì)用量下降了96%。由此證實,具有高電荷密度和比表面積的納米介質(zhì)更適合應用于同電荷介質(zhì)輔助蛋白質(zhì)復性的方法中。在上述研究的基礎上,針對重組蛋白在復性中的純化問題,本研究在瓊脂糖凝膠介質(zhì)(Sepharose FF)表面修飾亞氨基二乙酸(IDA),制備得到一種金屬螯合介質(zhì)IDA-Sepharose FF。利用IDA的負電性質(zhì)和金屬螯合性質(zhì),建立了一種同電荷輔助復性與集成純化的方法,用于輔助六聚組氨酸標記的重組增強型綠色熒光蛋白(6×his-EGFP)包含體的復性與純化。研究表明,IDA-Sepharose FF介質(zhì)能夠快速高效地輔助6×his-EGFP包含體的復性,并且在輔助復性的同時,能夠吸附部分雜蛋白,具有初步純化的效果。特別是在復性之后,通過引入少量鎳離子即可實現(xiàn)對6×his-EGFP的特異性吸附,最終得到高收率(85%)以及高純度(93%)的目標蛋白。進一步采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)接枝方法,制備得到高IDA接枝量的納米粒子,并且發(fā)現(xiàn)具有高電荷密度的金屬螯合納米粒子能夠進一步提高6×his-EGFP包含體的復性與純化效果,體現(xiàn)出其在實際應用中的更大優(yōu)勢。
【學位授予單位】：天津大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q51
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 蛋白質(zhì)的折疊復性
        1.1.1 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與活性
        1.1.2 蛋白質(zhì)的折疊機理
        1.1.3 影響蛋白質(zhì)折疊復性的關鍵因素
    1.2 促進蛋白質(zhì)二硫鍵形成的方法
        1.2.1 體內(nèi)促進蛋白質(zhì)二硫鍵形成的氧化還原酶
        1.2.2 體外促進蛋白質(zhì)二硫鍵形成的小分子氧化還原劑
    1.3 抑制蛋白質(zhì)聚集的方法
        1.3.1 體內(nèi)抑制蛋白質(zhì)聚集的分子伴侶
        1.3.2 體外抑制蛋白質(zhì)聚集的小分子抑制劑
        1.3.3 色譜復性
        1.3.4 其他抑制聚集的復性方法
    1.4 蛋白質(zhì)的親和純化技術
        1.4.1 親和純化的原理
        1.4.2 親和純化的種類
        1.4.3 金屬螯合親和純化
    1.5 本研究的內(nèi)容及意義
第二章 二硫鍵異構(gòu)酶模擬寡肽的設計及其促進蛋白質(zhì)氧化復性
    2.1 引言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 實驗材料
        2.2.2 蛋白質(zhì)的還原變性
        2.2.3 蛋白質(zhì)的氧化復性動力學
        2.2.4 蛋白質(zhì)的酶活測定
        2.2.5 二硫鍵氧化還原勢的測定
        2.2.6 巰醇pKa值的測定
    2.3 實驗結(jié)果與討論
        2.3.1 二硫鍵異構(gòu)酶模擬寡肽的設計
        2.3.2 不同氧化劑的比較
        2.3.3 較高濃度溶菌酶的復性
    2.4 小結(jié)
第三章 高電荷密度的納米粒子在蛋白質(zhì)吸附和同電荷蛋白質(zhì)復性中的應用
    3.1 引言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 實驗材料
        3.2.2 二氧化硅納米粒子表面的電荷修飾
        3.2.3 電荷修飾的納米粒子的表征
        3.2.4 溶菌酶的變性和復性
        3.2.5 溶菌酶的酶活測定
    3.3 實驗結(jié)果與討論
        3.3.1 電荷修飾的納米粒子的性質(zhì)表征
        3.3.2 電荷修飾的納米粒子對BSA的吸附
        3.3.3 電荷修飾的納米粒子輔助溶菌酶復性
        3.3.4 電荷修飾的納米粒子與微米球輔助溶菌酶復性效果的比較
    3.4 小結(jié)
第四章 同電荷金屬螯合介質(zhì)輔助 6×his-EGFP包含體的復性與集成純化過程
    4.1 引言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 實驗材料
        4.2.2 亞氨基二乙酸修飾的Sepharose FF介質(zhì)的制備
        4.2.3 IDA-Sepharose FF介質(zhì)的性質(zhì)表征
        4.2.4 重組綠色熒光蛋白包含體的制備
        4.2.5 包含體中目標蛋白 6×his-EGFP純度的測定
        4.2.6 總蛋白質(zhì)含量的測定
        4.2.7 天然 6×his-EGFP的純化
        4.2.8 活性 6×his-EGFP的熒光標準曲線測定
        4.2.9 6×his-EGFP的變性和復性
        4.2.10 IDA-Sepharose FF介質(zhì)的臨界金屬離子濃度測定
        4.2.11 復性后 6×his-EGFP的金屬螯合親和吸附
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 介質(zhì)的性質(zhì)表征
        4.3.2 純化 6×his-EGFP的復性
        4.3.3 6×his-EGFP的金屬螯合親和吸附
        4.3.4 6×his-EGFP包含體的復性與集成純化
    4.4 小結(jié)
第五章 高電荷密度的金屬螯合納米介質(zhì)強化 6×his-EGFP包含體的復性與集成純化
    5.1 引言
    5.2 材料和方法
        5.2.1 實驗材料
        5.2.2 ATRP方法制備接枝型納米粒子SNPs-PGI
        5.2.3 納米介質(zhì)SNPs-PGI的性質(zhì)表征
        5.2.4 天然 6×his-EGFP的純化和包含體的制備
        5.2.5 6×his-EGFP包含體的變性和復性
        5.2.6 鎳離子對復性后 6×his-EGFP包含體的分離純化
    5.3 實驗結(jié)果與討論
        5.3.1 SNPs-PGI的制備和性質(zhì)表征
        5.3.2 SNPs-PGI的電荷性質(zhì)和 6×his-EGFP吸附容量
        5.3.3 SNPs-PGI輔助 6×his-EGFP包含體復性
        5.3.4 SNPs-PGI對復性后 6×his-EGFP包含體的純化
    5.4 小結(jié)
第六章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 主要創(chuàng)新點
    6.3 展望
參考文獻
附錄
發(fā)表論文和參加科研情況說明
致謝

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本文編號：2887703