發(fā)布時(shí)間：2020-11-19 00:30

　　 混合模式層析(Mixed-mode chromatography, MMC)是一種新型的生物分離方法,其配基兼有疏水、靜電、氫鍵等多種相互作用,具有吸附容量高、選擇性好、洗脫條件溫和等特點(diǎn),已取得較好的應(yīng)用。本文以對(duì)氨基馬尿酸為配基的商業(yè)化混合模式介質(zhì)Nuvia cPrime為參照,在課題組前期研究基礎(chǔ)上,選取聚丙烯酸甲酯微球?yàn)榛�質(zhì),偶聯(lián)5-氨基苯并咪唑(ABI)制得新型混合模式介質(zhì)KB-ABI,以免疫球蛋白和血清白蛋白為模型蛋白,系統(tǒng)考察了兩種混合模式介質(zhì)的蛋白吸附性能,探討了模擬血清和單克隆抗體分離,并借助共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy, CLSM)對(duì)蛋白傳質(zhì)和吸附過(guò)程進(jìn)行了分析。主要結(jié)果如下：(1)以牛免疫球蛋白G (bIgG)和牛血清白蛋白(BSA)為模型蛋白,考察了Nuvia cPrime介質(zhì)的靜態(tài)吸附、柱吸附和洗脫行為。結(jié)果表明,pH和鹽濃度對(duì)兩種蛋白的吸附具有不同影響,在pH 6.0時(shí)兩種蛋白的吸附量出現(xiàn)最大差異,吸附量隨NaCl濃度升高而降低,隨(NH4)2SO4濃度升高出現(xiàn)“U”型變化。調(diào)節(jié)pH和鹽濃度可以提高Nuvia cPrime對(duì)bIgG和BSA的分離選擇性,以pH 6.0、0.8 M (NH4)2SO4上樣吸附,pH8.0、1.0MNaCl洗脫,可實(shí)現(xiàn)bIgG和BSA的有效分離。(2)以人免疫球蛋白G (hIgG)和BSA為模型蛋白,考察不同比例混合后在Nuvia cPrime介質(zhì)上的共吸附行為。發(fā)現(xiàn)兩種蛋白存在一定的競(jìng)爭(zhēng)性關(guān)系,hIgG占據(jù)明顯的主導(dǎo)地位,pH 6.0時(shí)最為明顯,固相和液相中hIgG/BSA的摩爾比差別高達(dá)10倍。采用單組分吸附等溫線的擬合參數(shù),分別用Extended Langmuir (EL)和Extended Langmuir-Freundlich (ELF)吸附模型對(duì)雙組分蛋白的共吸附行為進(jìn)行了預(yù)測(cè),計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)值吻合較好。(3)以聚丙烯酸甲酯微球?yàn)榛�質(zhì),ABI為功能配基,制得新型混合模式介質(zhì)KB-ABI,配基密度高達(dá)195 μ/mL�？疾炝薶IgG和BSA的靜態(tài)吸附,發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)的pH依賴(lài)性和耐鹽吸附特性,hIgG吸附容量在pH 8.0時(shí)達(dá)到最大,BSA吸附容量隨pH升高而逐漸下降�？疾炝穗p組分蛋白的共吸附行為,表明兩種蛋白吸附存在競(jìng)爭(zhēng)性,pH 5.0和8.0時(shí)表現(xiàn)突出,并采用EL和ELF模型對(duì)共吸附行為進(jìn)行了分析,計(jì)算結(jié)果偏差較小�？疾炝藘煞N蛋白的柱吸附行為,以pH8.0、0.2MNaCl平衡上樣,pH 5.0緩沖液洗脫,可以分離hIgG和BSA。(4)考察了Nuvia cPrime和KB-ABI兩種介質(zhì)對(duì)hIgG和BSA單組分和雙組分蛋白的吸附動(dòng)力學(xué)行為。發(fā)現(xiàn)兩種蛋白存在一定的競(jìng)爭(zhēng)吸附關(guān)系,40 min時(shí)BSA吸附出現(xiàn)明顯的峰值,隨后逐步下降,說(shuō)明hIgG對(duì)BSA的競(jìng)爭(zhēng)取代作用。采用吸附動(dòng)力學(xué)模型對(duì)單、雙組分的吸附動(dòng)力學(xué)曲線進(jìn)行了擬合,得到表面擴(kuò)散系數(shù)Ds,發(fā)現(xiàn)pH改變對(duì)hIgG的Ds影響很小,而B(niǎo)SA在兩種介質(zhì)中呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。(5)以模擬血清(IgG:BSA=1:4)和CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清液為料液,以IgG純度和收率、宿主細(xì)胞蛋白(HCP)去除效果等為指標(biāo),比較Nuvia cPrime和KB-ABI兩種介質(zhì)的抗體分離性能。對(duì)于Nuvia cPrime,模擬血清分離IgG的純度和收率分別為99.8%和92.7%,CHO培養(yǎng)液中mAb分離純度和收率分別為92.8%和82.5%。對(duì)于KB-ABI,模擬血清分離IgG的純度和收率分別達(dá)99.7%和94.6%,CHO培養(yǎng)液中mAb分離純度達(dá)到94.9%,收率92.5%。對(duì)于HCP去除,KB-ABI的效果與ProteinA親和層析相當(dāng),明顯優(yōu)于Nuvia cPrim,顯示出良好的應(yīng)用前景。(6)采用CLSM分析蛋白質(zhì)的傳質(zhì)和吸附過(guò)程,探討Nuvia cPrime和KB-ABI介質(zhì)的吸附分離機(jī)制。驗(yàn)證了熒光標(biāo)記對(duì)蛋白吸附影響較小,考察了不同pH下單組分hIgG和BSA的吸附行為,發(fā)現(xiàn)兩種蛋白都表現(xiàn)出孔擴(kuò)散和表面擴(kuò)散相結(jié)合的傳質(zhì)機(jī)制,并實(shí)現(xiàn)了熒光強(qiáng)度和宏觀吸附容量的定量關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步采用雙熒光標(biāo)記,考察了雙組分蛋白的吸附行為,分析了兩種蛋白的競(jìng)爭(zhēng)性取代機(jī)制,并探討了Overshoot現(xiàn)象的形成機(jī)理。最后考察了蛋白質(zhì)的解吸和順序吸附,發(fā)現(xiàn)介質(zhì)表面與蛋白具有較強(qiáng)的結(jié)合力,兩種介質(zhì)的吸附過(guò)程存在一定的差異。本文圍繞兩種新型MMC介質(zhì),從蛋白吸附性能出發(fā),探討pH和添加鹽影響,分析不同蛋白的吸附差異,優(yōu)化抗體分離工藝,并利用CLSM探討不同介質(zhì)的傳質(zhì)分離機(jī)制,相關(guān)結(jié)果將有助于促進(jìn)MMC的抗體分離應(yīng)用。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類(lèi)】：O629.73
【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
符號(hào)表
縮略語(yǔ)表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 引言
    1.2 生物分離過(guò)程中的層析技術(shù)
        1.2.1 離子交換層析
        1.2.2 親和層析
        1.2.3 疏水相互作用層析
        1.2.4 凝膠過(guò)濾層析
    1.3 混合模式層析
        1.3.1 混合模式層析原理
        1.3.2 混合模式層析的種類(lèi)
        1.3.3 混合模式功能配基
        1.3.4 混合模式層析的應(yīng)用
    1.4 多組分蛋白吸附
        1.4.1 多組分吸附平衡模型
        1.4.2 多組分蛋白質(zhì)吸附的研究進(jìn)展
    1.5 層析介質(zhì)內(nèi)的蛋白傳質(zhì)行為研究
        1.5.1 宏觀方法
        1.5.2 微觀方法
    1.6 共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)
        1.6.1 簡(jiǎn)介
        1.6.2 工作原理
        1.6.3 CLSM的應(yīng)用
        1.6.4 CLSM用于蛋白吸附研究的局限性
    1.7 本論文的研究思路
第二章 Nuvia cPrime介質(zhì)的蛋白吸附性能
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 儀器與試劑
        2.2.2 吸附等溫線測(cè)定
        2.2.3 層析柱中吸附行為
        2.2.4 層析柱中解吸行為
        2.2.5 Zeta電位測(cè)定
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 蛋白的Zeta電位
        2.3.2 pH對(duì)bIgG和BSA靜態(tài)吸附的影響
        2.3.3 鹽濃度對(duì)bIgG和BSA靜態(tài)吸附的影響
        2.3.4 層析柱中吸附行為
        2.3.5 層析柱中洗脫行為
    2.4 本章小結(jié)
第三章 Nuvia cPrime介質(zhì)對(duì)混合蛋白的吸附性能
    3.1 引言
    3.2 吸附理論模型
        3.2.1 單組分靜態(tài)吸附模型
        3.2.2 雙組分競(jìng)爭(zhēng)性吸附模型
        3.2.3 雙組分吸附的預(yù)測(cè)
        3.2.4 誤差分析
        3.2.5 吸附動(dòng)力學(xué)模型
    3.3 材料與方法
        3.3.1 試劑與儀器
        3.3.2 蛋白質(zhì)定量分析
        3.3.3 吸附等溫線測(cè)定
        3.3.4 吸附動(dòng)力學(xué)曲線測(cè)定
        3.3.5 Zeta電位測(cè)定
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 蛋白的Zeta電位
        3.4.2 混合蛋白濃度的定量分析
        3.4.3 單一組分吸附
        3.4.4 雙組分吸附
        3.4.5 單一和混合蛋白的吸附動(dòng)力學(xué)
    3.5 本章小結(jié)
第四章 混合模式介質(zhì)KB-ABI制備及蛋白吸附性能
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 試劑與儀器
        4.2.2 介質(zhì)制備
        4.2.3 活化密度測(cè)定
        4.2.4 配基密度測(cè)定
        4.2.5 吸附等溫線測(cè)定
        4.2.6 吸附動(dòng)力學(xué)曲線測(cè)定
        4.2.7 層析柱中吸附行為
        4.2.8 蛋白質(zhì)定量分析
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 KB-ABI介質(zhì)制備
        4.3.2 單組分蛋白的靜態(tài)吸附
        4.3.3 雙組分蛋白的靜態(tài)吸附
        4.3.4 吸附動(dòng)力學(xué)曲線
        4.3.5 柱吸附行為
    4.4 本章小結(jié)
第五章 混合模式層析分離免疫球蛋白G和抗體
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 試劑與儀器
        5.2.2 IgG/BSA混合蛋白中分離IgG
        5.2.3 CHO細(xì)胞培養(yǎng)液中分離mAb
        5.2.4 Protein A親和層析
        5.2.5 蛋白定量分析
        5.2.6 蛋白電泳分析
        5.2.7 CHO宿主細(xì)胞蛋白測(cè)定
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 Nuvia cPrime介質(zhì)層析分離性能
        5.3.2 KB-ABI介質(zhì)的層析分離性能
        5.3.3 CHO宿主細(xì)胞蛋白分析
    5.4 本章小結(jié)
第六章 介質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)吸附過(guò)程的CLSM分析
    6.1 引言
    6.2 材料及方法
        6.2.1 試劑與儀器
        6.2.2 蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記
        6.2.3 熒光蛋白的分離純化
        6.2.4 標(biāo)記蛋白的吸附
        6.2.5 標(biāo)記蛋白的解吸
        6.2.6 蛋白的次序吸附
        6.2.7 CLSM觀測(cè)
    6.3 結(jié)果與討論
        6.3.1 熒光標(biāo)記對(duì)蛋白吸附行的影響
        6.3.2 Nuvia cPrime介質(zhì)吸附的CLSM分析
        6.3.3 KB-ABI介質(zhì)吸附的CLSM分析
        6.3.4 CLSM分析和宏觀吸附的關(guān)聯(lián)
        6.3.5 蛋白解吸的CLSM分析
        6.3.6 蛋白順序吸附的CLSM分析
    6.4 本章小結(jié)
第七章 結(jié)論與展望
    7.1 結(jié)論
    7.2 建議與展望
參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間的研究成果
作者簡(jiǎn)介

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2889429