發(fā)布時(shí)間：2025-02-09 12:29

　　金屬硫蛋白(Metallothionein,MTs)是一類含有豐富的半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白,能減少自由基對(duì)機(jī)體的損傷,其在抗衰老,抗氧化,抗腫瘤等過(guò)程中發(fā)揮著重要影響。本實(shí)驗(yàn)室前期成功從河南華溪蟹(Sinopotamon henanense)中克隆出MT cDNA全長(zhǎng)并進(jìn)行了一系列研究。以此為基礎(chǔ),本研究引入人免疫缺陷病毒反式激活因子(Human immunodeficiency virus transactivator,TAT)穿膜肽,旨在制備一種由TAT介導(dǎo)的能夠跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入生物體細(xì)胞的MT,并進(jìn)一步研究其穿膜活性及對(duì)細(xì)胞氧化損傷的修復(fù)作用。主要研究?jī)?nèi)容為:首先利用生物信息學(xué)軟件分析融合蛋白TAT-MT的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的變化;通過(guò)PCR技術(shù)在目的基因中加入TAT序列,構(gòu)建pMD19-T-TAT-MT克隆載體和pEXsec1-TAT-MT、pET28a-SUMO-TAT-MT、pET28a-TAT-MT等原核表達(dá)載體;表達(dá)TAT-MT重組蛋白并用親和層析方法進(jìn)行分離純化;利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)重組融合蛋白TAT-MT的穿膜活性;測(cè)定TAT-MT的體外羥自由基清除率及總抗氧化能力;利用MT...

【文章頁(yè)數(shù)】：79 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 綜述
    1 金屬硫蛋白概述
        1.1 金屬硫蛋白的理化特性
        1.2 金屬硫蛋白的生理功能
    2 細(xì)胞穿膜肽概述
        2.1 HIV-TAT穿膜肽的結(jié)構(gòu)
        2.2 TAT蛋白穿膜的機(jī)制
        2.3 TAT蛋白的應(yīng)用
    3 重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)的選擇
    4 本論文的研究目的及意義
第二章 河南華溪蟹TAT-MT重組融合蛋白的生物信息學(xué)分析
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
    2 結(jié)果
        2.1 TAT-MT融合蛋白理化性質(zhì)分析
        2.2 TAT-MT融合蛋白親水性/疏水性預(yù)測(cè)與分析
        2.3 TAT-MT融合蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)與分析
        2.4 TAT-MT融合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析
        2.5 TAT-MT融合蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析
    3 討論
第三章 河南華溪蟹TAT-MT融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器
        1.4 實(shí)驗(yàn)方法
    2 結(jié)果
        2.1 長(zhǎng)引物PCR擴(kuò)增TAT-MT、MT基因
        2.2 克隆載體的構(gòu)建
        2.3 原核表達(dá)載體pET28a-SUMO-MT、pET28a-SUMO-TAT-MT的構(gòu)建
        2.4 原核表達(dá)載體pEXsec1-TAT-MT、pET28a-TAT-MT的構(gòu)建
    3 討論
第四章 河南華溪蟹TAT-MT融合蛋白的優(yōu)化表達(dá)與純化
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器
        1.4 實(shí)驗(yàn)方法
    2 結(jié)果
        2.1 重組SUMO-MT、SUMO-TAT-MT、TAT-MT誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化
        2.2 重組TAT-MT融合蛋白的純化
    3 討論
第五章 TAT-MT的細(xì)胞膜穿透作用及活性檢測(cè)
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器
        1.4 實(shí)驗(yàn)方法
    2 結(jié)果
        2.1 TAT介導(dǎo)的金屬硫蛋白的細(xì)胞穿膜能力
        2.2 TAT介導(dǎo)的金屬硫蛋白對(duì)細(xì)胞氧化損傷的修復(fù)作用
        2.3 TAT介導(dǎo)的金屬硫蛋白羥自由基清除率的測(cè)定
        2.4 TAT介導(dǎo)的金屬硫蛋白總抗氧化能力(T-AOC)的測(cè)定
    3 討論
第六章 總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)況及聯(lián)系方式



本文編號(hào)：4032232