骨細胞Smad4通過Notch信號調控成骨分化的機制研究
發(fā)布時間：2020-12-09 13:03
目的:本研究選擇Notch信號配體Delta-like基因,建立穩(wěn)定表達外源Dll1、Dll3及Dll4基因的MLO-Y4骨細胞株,研究骨細胞Notch信號Delta-like類配體Dll1、Dll3及Dll4對骨髓基質細胞（Bone marrow Stromal cell,BMSC）成骨分化的影響,明確Notch信號Delta-like配體是否具有促成骨作用,以揭示骨細胞Smad4促進骨形成的分子機制。方法:（1）采用基因克隆技術制備慢病毒過表達Dll1、Dll3及Dll4基因的載體,將三個目的基因分別克隆至慢病毒過表達載體pLent-GFP-PURO-cmv（Flag）。（2）將慢病毒過表達載體與慢病毒包裝系統質粒（psPAX2、pMD2.G）共轉染293T細胞,獲得的慢病毒原液感染MLO-Y4樣骨細胞,嘌呤霉素篩選分別穩(wěn)定表達Dll1、Dll3及Dll4基因的MLO-Y4樣骨細胞。并采用實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,QPCR）對篩選出來的MLO-Y4樣骨細胞中Dll1、Dll3及Dll4基因的表達進行鑒定。（3）將三種穩(wěn)定表達Delta...
【文章來源】：重慶醫(yī)科大學重慶市
【文章頁數】：72 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
Delta-like基因重組慢病毒過表達載體電泳結果
重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文33圖3.2Delta-like基因重組慢病毒過表達載體測序結果。（A）、（B）和（C）分別為pLent-GFP-Dll1、Dll3及Dll4部分測序峰圖。注：（A）：pLent-GFP-Dll1；（B）：pLent-GFP-Dll3；（C）：pLent-GFP-Dll4Fig.3.2ThesequencingresultsforrecombinantlentivirusoverexpressionvectorofDelta-likegenes.(A),(B)and(C)arepartialsequencingpeaksofpLent-GFP-Dll1,Dll3andDll4,respectively.Note:(A):pLent-GFP-Dll1;(B):pLent-GFP-Dll3;(C):pLent-GFP-Dll43.2Delta-like重組慢病毒過表達質粒的包裝及滴度測定采用三質粒包裝系統將重組慢病毒過表達質粒與包裝質粒（psPAX2、pMD2.G）共同轉染293T細胞，24h后在熒光顯微鏡下觀察GFP表達。轉染后48h均出現綠色熒光，說明重組慢病毒質粒包裝成功（圖3.3）。48h和96h左右收集病毒上清液并濃縮，測得Dll1、Dll3及Dll4慢病毒過表達質粒離心濃縮后的滴度分別為1×107、3×107、3×107pfu/mL，對照質粒達到2×108pfu/mL。
重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文35圖3.4不同MOI值的重組過表達慢病毒轉染MLO-Y4細胞的效率（100×）。Dll1、Dll3、Dll4及對照質粒慢病毒分別以20、60、100、120的MOI值轉染MLO-Y4細胞，72h后在熒光顯微鏡下觀察到GFP在細胞中表達。（A）、（B）、（C）和（D）分別為pLent-GFP-control、Dll1、Dll3及Dll4。注：（A）：pLent-GFP-control；（B）：pLent-GFP-Dll1；（C）：pLent-GFP-Dll3；（D）：pLent-GFP-Dll4Fig.3.4TheefficiencyofrecombinantoverexpressionlentivirustransfectingMLO-Y4cellswithdifferentMOIvalues(100×).ThelentivirusesofDll1,Dll3,Dll4andcontrolplasmidsweretransfectedintoMLO-Y4cellswithMOIvaluesof20,60,100,120andGFPwasobservedinthesecellsunderafluorescencemicroscope72hourslater.(A),(B),(C)and(D)arepLent-GFP-control,Dll1,Dll3andDll4,respectively.Note:(A):pLent-GFP-control;(B):pLent-GFP-Dll1;(C):pLent-GFP-Dll3;(D):pLent-GFP-Dll4選擇MOI值為120的慢病毒轉染接種于六孔板的MLO-Y4細胞，72h后觀察到綠色熒光。3個目的基因過表達慢病毒及對照慢病毒的轉染率均在80%以上（圖3.5）。用含嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基篩選10d后獲得了穩(wěn)定轉染的陽性MLO-Y4細胞。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]Smad4促進成骨分化的機制研究[J]. 劉俊銀,馮瑋,涂小林. 中國骨質疏松雜志. 2019(05)
本文編號：2906904
【文章來源】：重慶醫(yī)科大學重慶市
【文章頁數】：72 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
Delta-like基因重組慢病毒過表達載體電泳結果
重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文33圖3.2Delta-like基因重組慢病毒過表達載體測序結果。（A）、（B）和（C）分別為pLent-GFP-Dll1、Dll3及Dll4部分測序峰圖。注：（A）：pLent-GFP-Dll1；（B）：pLent-GFP-Dll3；（C）：pLent-GFP-Dll4Fig.3.2ThesequencingresultsforrecombinantlentivirusoverexpressionvectorofDelta-likegenes.(A),(B)and(C)arepartialsequencingpeaksofpLent-GFP-Dll1,Dll3andDll4,respectively.Note:(A):pLent-GFP-Dll1;(B):pLent-GFP-Dll3;(C):pLent-GFP-Dll43.2Delta-like重組慢病毒過表達質粒的包裝及滴度測定采用三質粒包裝系統將重組慢病毒過表達質粒與包裝質粒（psPAX2、pMD2.G）共同轉染293T細胞，24h后在熒光顯微鏡下觀察GFP表達。轉染后48h均出現綠色熒光，說明重組慢病毒質粒包裝成功（圖3.3）。48h和96h左右收集病毒上清液并濃縮，測得Dll1、Dll3及Dll4慢病毒過表達質粒離心濃縮后的滴度分別為1×107、3×107、3×107pfu/mL，對照質粒達到2×108pfu/mL。
重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文35圖3.4不同MOI值的重組過表達慢病毒轉染MLO-Y4細胞的效率（100×）。Dll1、Dll3、Dll4及對照質粒慢病毒分別以20、60、100、120的MOI值轉染MLO-Y4細胞，72h后在熒光顯微鏡下觀察到GFP在細胞中表達。（A）、（B）、（C）和（D）分別為pLent-GFP-control、Dll1、Dll3及Dll4。注：（A）：pLent-GFP-control；（B）：pLent-GFP-Dll1；（C）：pLent-GFP-Dll3；（D）：pLent-GFP-Dll4Fig.3.4TheefficiencyofrecombinantoverexpressionlentivirustransfectingMLO-Y4cellswithdifferentMOIvalues(100×).ThelentivirusesofDll1,Dll3,Dll4andcontrolplasmidsweretransfectedintoMLO-Y4cellswithMOIvaluesof20,60,100,120andGFPwasobservedinthesecellsunderafluorescencemicroscope72hourslater.(A),(B),(C)and(D)arepLent-GFP-control,Dll1,Dll3andDll4,respectively.Note:(A):pLent-GFP-control;(B):pLent-GFP-Dll1;(C):pLent-GFP-Dll3;(D):pLent-GFP-Dll4選擇MOI值為120的慢病毒轉染接種于六孔板的MLO-Y4細胞，72h后觀察到綠色熒光。3個目的基因過表達慢病毒及對照慢病毒的轉染率均在80%以上（圖3.5）。用含嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基篩選10d后獲得了穩(wěn)定轉染的陽性MLO-Y4細胞。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]Smad4促進成骨分化的機制研究[J]. 劉俊銀,馮瑋,涂小林. 中國骨質疏松雜志. 2019(05)
本文編號：2906904
本文鏈接：http://www.lk138.cn/shoufeilunwen/benkebiyelunwen/2906904.html
