發(fā)布時間：2020-12-02 12:35

　　絲狀真菌對蛋白質(zhì)表達和修飾具有其他微生物不可比擬的優(yōu)勢,被廣泛的應(yīng)用于工業(yè)酶的生產(chǎn)當中。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和高通量測序的發(fā)展,關(guān)于絲狀真菌表達重組蛋白的研究也越來越多。然而單一的菌種不能滿足于各種不同工業(yè)酶生產(chǎn)的需求,因此,越來越多的絲狀真菌已經(jīng)加入到表達宿主菌的行列中。嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilum）是一種腐生真菌,它的分布范圍很廣,能夠在45°C⁵0°C范圍內(nèi)正常生長繁殖,具有生產(chǎn)多種耐熱型纖維素水解酶的能力,是潛在的工業(yè)纖維素生產(chǎn)菌株。與中溫真菌相比,嗜熱真菌產(chǎn)生的纖維素酶具有高活力和熱穩(wěn)定性,并且種類更為豐富。多糖單加氧酶（polysaccharide monooxygenases,PMOs）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類纖維素降解酶,因其氧化降解纖維素的獨特機制而備受人們的關(guān)注。本研究依托于嗜熱毛殼菌良好的基因組學和蛋白質(zhì)組學研究資源,從載體的改造和蛋白的誘導表達方面開展研究,以嗜熱毛殼菌中AA9（Auxiliary Activity 9,AA9）家族多糖單加氧酶PMO1為對象,首次利用嗜熱毛殼菌蛋白表達系統(tǒng)成功表達了該酶,并對該酶的氧化... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學山東省

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

pNK54載體的質(zhì)粒圖譜以及克隆位點Fig.2.1MapandmultiplecloningsitesofcarrierpNK-54

山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文253結(jié)果與分析3.1PMO1基因的序列分析和克隆嗜熱毛殼菌Chath2p7_007187基因，即PMO1編碼含有247個氨基酸的蛋白，首先對嗜熱毛殼菌PMO1全長核苷酸編碼的氨基酸進行序列分析，分析結(jié)果顯示，PMO1酶含有一個有信號肽，表明它是胞外分泌蛋白（圖3.1）。由于多糖單加氧酶信號肽后第一位氨基酸為活性中心，需要保證其信號肽第一位氨基酸充分暴露出來，所以保留其自身信號肽，確保信號肽的正確切割。以嗜熱毛殼菌DNA為模板，設(shè)計引物時保留其自身信號肽和內(nèi)含子，從中擴增目的基因（圖3.2），保證表達出的蛋白最接近天然的狀態(tài)。用DNAMAN軟件分析蛋白質(zhì)的序列，理論分子量的大小為26KD。信號肽預測網(wǎng)站Signal4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）。圖3.1嗜熱毛殼菌PMO1信號肽分析圖譜Fig.3.1SignalpeptideanalysisofPMO1inChaetomiumthermophilus圖3.2嗜熱毛殼菌PMO1完整序列Figure3.2CompletesequenceofChaetomiumthermophilusPMO1

山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文253結(jié)果與分析3.1PMO1基因的序列分析和克隆嗜熱毛殼菌Chath2p7_007187基因，即PMO1編碼含有247個氨基酸的蛋白，首先對嗜熱毛殼菌PMO1全長核苷酸編碼的氨基酸進行序列分析，分析結(jié)果顯示，PMO1酶含有一個有信號肽，表明它是胞外分泌蛋白（圖3.1）。由于多糖單加氧酶信號肽后第一位氨基酸為活性中心，需要保證其信號肽第一位氨基酸充分暴露出來，所以保留其自身信號肽，確保信號肽的正確切割。以嗜熱毛殼菌DNA為模板，設(shè)計引物時保留其自身信號肽和內(nèi)含子，從中擴增目的基因（圖3.2），保證表達出的蛋白最接近天然的狀態(tài)。用DNAMAN軟件分析蛋白質(zhì)的序列，理論分子量的大小為26KD。信號肽預測網(wǎng)站Signal4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）。圖3.1嗜熱毛殼菌PMO1信號肽分析圖譜Fig.3.1SignalpeptideanalysisofPMO1inChaetomiumthermophilus圖3.2嗜熱毛殼菌PMO1完整序列Figure3.2CompletesequenceofChaetomiumthermophilusPMO1

【參考文獻】：
期刊論文
[1]利用黑曲霉高效表達外源蛋白策略[J]. 段成寶,劉鋼.  菌物研究. 2019(03)
[2]絲狀真菌啟動子的基因工程改造進展[J]. 孫先花,蘇小運.  廣西科學. 2017(01)
[3]絲狀真菌高效表達異源蛋白的研究進展[J]. 劉瑞.  生物技術(shù)世界. 2015(06)
[4]絲狀真菌啟動子研究進展[J]. 林濤,黃建忠.  安徽農(nóng)業(yè)科學. 2013(07)
[5]Construction and Secretory Expression of β-Galactosidase Gene from Lactobacillus Bulgaricus in Lactococcus Lactis[J]. ZHANG Wen1,3,WANG Chuan2,#,HUANG Cheng Yu1,#,YU Qian2,LIU Heng Chuan2,ZHANG Chao Wu2,and PEI Xiao Fang2 1.Department of Nutrition and Food Hygiene,West China School of Public Health,Sichuan University,Chengdu 610041,Sichuan,China;2.Department of Medical Technology,West China School of Public Health,Sichuan University,Chengdu 610041,Sichuan,China;3.Central Hospital of Sichuan Petroleum Bureau,Chengdu 610213,Sichuan,China.  Biomedical and Environmental Sciences. 2012(02)
[6]工業(yè)酶蛋白研究的重要進展[J]. 林章凜,陳博.  生物產(chǎn)業(yè)技術(shù). 2010(04)
[7]絲狀真菌異源蛋白高效表達的研究進展[J]. 劉德輝,黃毓茂,徐蕙.  中國生物制品學雜志. 2010(02)
[8]提高蛋白質(zhì)在米曲霉中表達量的策略[J]. 張建軍,蔡容華,李強,施碧紅.  中國生物工程雜志. 2009(01)
[9]嗜熱真菌的生物轉(zhuǎn)化功能與經(jīng)濟價值[J]. 連賓,劉叢強.  地球與環(huán)境. 2004(02)

碩士論文
[1]嗜熱毛殼菌多糖單加氧酶的性質(zhì)及協(xié)同作用研究[D]. 王美霞.山東農(nóng)業(yè)大學 2019
[2]太瑞斯梭孢殼霉糖代謝酶基因表達研究及組成型表達系統(tǒng)的構(gòu)建[D]. 余培鎧.深圳大學 2015



本文編號：2895319