發(fā)布時間：2020-03-29 21:27

【摘要】：氯代乙酰胺類除草劑因分子結構中具有酰胺基團(CONH-)而得名,因其高效、高選擇性而在全球范圍內廣泛使用。乙草胺[2’-乙基-6’-甲基-N-(乙氧基甲基)-2-氯代-N-乙酰苯胺]是氯代乙酰胺類除草劑的重要代表,主要用于一年生禾本科雜草和部分闊葉雜草的防除。乙草胺的主要生物降解產(chǎn)物為2-氯-N-(2’-甲基-6’-乙基苯基)乙酰胺(CMEPA)和2-甲基-6-乙基苯胺(MEA),研究表明殘留在環(huán)境中的乙草胺及其降解中間產(chǎn)物對環(huán)境和農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)都具有一定的危害。本實驗室以乙草胺為靶標,篩選到一株能將乙草胺轉化為CMEPA的菌株Rhodococcus sp. T3-1和一株能將CMEPA水解為MEA的菌株Delftia sp. T3-6.本文以Rhodococcus sp. T3-1為材料,對乙草胺N-脫乙氧甲基酶(簡稱N-脫烷基酶)基因進行克隆,以Delftia sp. T3-6為材料,對CMEPA水解酶基因進行克隆,并對重組酶的酶學性質進行了研究�？焖儆行У拿富顪y定方法是蛋白質純化的前提,本論文首先建立了一種快速測定CMEPA水解產(chǎn)物MEA的方法。在20 mM Tris-HCl (pH 7.0)緩沖液中,10-50μM的2,6-甲乙基苯胺在鐵氰化鉀催化下與4-氨基安替比林反應生成紫紅色物質,該物質在535 nm的吸光值與MEA濃度有良好的線性關系,底物CMEPA、 SDS、甲醇等有機試劑、1 mM的金屬離子對顯色反應無顯著影響。溫度和pH對顯色反應影響顯著。該方法也適用于其它苯胺苯酚類衍生物的測定。通過硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose離子交換層析、Butyl-650M疏水層析和Superdex G-200凝膠層析4步純化流程,獲得達電泳純的目的蛋白(DamH).純化倍數(shù)為17.7倍,蛋白回收率為0.29%。肽指紋分析得到兩條肽段APEADDELRR和TNPLANPLKASYQGFPR, N端測序15個氨基酸序列為Gly-Thr-Ser-Pro-Gln-Ser-Asp-Phe-Leu-Arg-Ala-Leu-Phe-Gln-Ser.根據(jù)N端氨基酸序列及肽指紋圖譜設計引物,利用染色體步移技術克隆到Ilelftia sp. T3-6 CMEPA水解酶編碼基因damH,該基因全長903 bp,編碼300個氨基酸,分子量為32 kDa,與來源于Acinetobacter sp. SE19的環(huán)已醇降解基因簇的ChnC一致性為67%。構建表達菌株E. coli BL21(DE3)-(pET-29a(+)-JamH),經(jīng)誘導培養(yǎng)后,實現(xiàn)重組酶DamH在E. coli BL21(DE3)中的異源表達。DamH是一個具有酯類水解活性的酰胺水解酶,在以CMEPA為底物時比活力為5036 U/mg,在以4-硝基苯酯為底物時比活力為612U/mg。DamH最適底物為CMEPA,其Km和kcat值分別為0.197 mM和2804.32 s-1。DamH具有催化芳基酰胺類化合物水解和對硝基苯酯類、三酰甘油酯和ε-已內酯水解的能力,最適酶反應pH為6.5,最適酶反應溫度為35℃。Mn2+離子對酶活有促進作用,Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe2+對酶活有抑制作用；PMSF、SDS強烈抑制酶的活性,而EDTA和DMSO對酶活影響較小。定點突變實驗結果顯示DamH活性中心可能由S149-E244-H274三聯(lián)體結構組成,除活性中心構成外,三維結構模擬結果也顯示DamH與酯酶3FAK類似,具有一個典型的Gly-X-Ser-X-Gly保守序列和S149,E244,H274三聯(lián)體催化中心以及HGX結構(79HGG81)。DamH在蛋白濃度為15 mg/mL,結晶池母液為：0.2 M乙酸銨,pH7.1,21%PEG 3350,坐滴氣相擴散法20℃下約18天能長出衍射能力達3.4 A的晶體。乙草胺的降解首先要進行N-脫乙氧甲基,生成CMEPA進而被DamH水解為MEA。該過程由乙草胺N-脫烷基酶催化完成,乙草胺N-脫烷基酶性質非常不穩(wěn)定,普通的超聲波破碎法會導致酶快速失活。本論文首先研究了細胞破碎提取乙草胺N-脫烷基酶粗酶液的方法和測活體系,建立了以液氮研磨方法制備Rhodococcus sp. T3-1粗酶液的方法,在含1 mM NADH+H+,40%蔗糖,0.1 M NaCl,10mM MgCl2,2mMβ-巰基乙醇的20 mM Tris-HCl (pH 7.0)緩沖液中,利用粗酶液和DamH兩步催化形成MEA,利用顯色法可間接檢測到乙草胺N-脫烷基酶活性。通過硫酸銨分級沉淀、疏水層析從Rhodococcus sp. T3-1粗酶液中分離到三個蛋白,肽指紋圖譜結果顯示三個蛋白分別為鐵氧化還原酶EthA (45 kDa)、鐵氧還蛋白EthD(11kDa)和細胞色素P450單加氧酶EthB (43 kDa)。基于氨基酸序列分析和核酸序列分析,設計引物擴增ethABCD基因簇,分別構建不同基因組織形式的表達菌株,以誘導表達菌株全細胞進行催化實驗證實了參與乙草胺N-脫乙氧甲基反應的三個蛋白為EthA-EthD-EthB。
【圖文】：

２．２．２芳基憸胺酶和憸胺酶的特征逡逑蛋白質晶體學的發(fā)展使從原子水平上認識酶的反應機制成為可能，Ａｋａｓｈｉ邋Ｏｈ化ｋｉ逡逑等解析了來源于巧々0加ｃｏｃｃｗ邋ｓｐ．邋Ｎ－７７１的ＲｈＡｍｉｄａｓｅ邋（ＰＤＢ：邋３Ａ１Ｋ）的結構（圖１－９）。逡逑ＲｈＡｍｉｄａｓｅ能水解己憸胺、丙憸胺、苯甲櫼胺，其活性中也由Ｓｅｒｌ７１，Ｓｅｒｌ９５和Ｌｙｓ９６逡逑Ｈ個氨基酸殘基組成（圖１－１０），其中Ｓｅｒｌ７１位于一段憸胺酶家族高度保守的序列逡逑（Ｇ１６９－Ｇ１７０－Ｓ１７１－Ｓ１７２－Ｇ１７３－Ｇ１７４）之中［９５］。逡逑圖１－９邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ結構示意圖逡逑巧ｇ．邋１－９邋Ｃｒｙｓｔａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ逡逑ＰｈｅｌｉＳｓ／逡逑^6逡逑＾邐Ｓｅｒ１７１逡逑Ａｌａ１９５邋巧邋ｅｒ１９邋巧、邐、逡逑Ｌｙｓ９６邋／逡逑圖１－１０邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ的活性中屯及與底物結合方式逡逑Ｆｉｇ．邋１－１０邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ａｃｔｉｖｅ邋ｓｉ化邋ｏｆ邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ逡逑１２逡逑

２．２．２芳基憸胺酶和憸胺酶的特征逡逑蛋白質晶體學的發(fā)展使從原子水平上認識酶的反應機制成為可能，Ａｋａｓｈｉ邋Ｏｈ化ｋｉ逡逑等解析了來源于巧々0加ｃｏｃｃｗ邋ｓｐ．邋Ｎ－７７１的ＲｈＡｍｉｄａｓｅ邋（ＰＤＢ：邋３Ａ１Ｋ）的結構（圖１－９）。逡逑ＲｈＡｍｉｄａｓｅ能水解己憸胺、丙憸胺、苯甲櫼胺，其活性中也由Ｓｅｒｌ７１，Ｓｅｒｌ９５和Ｌｙｓ９６逡逑Ｈ個氨基酸殘基組成（圖１－１０），其中Ｓｅｒｌ７１位于一段憸胺酶家族高度保守的序列逡逑（Ｇ１６９－Ｇ１７０－Ｓ１７１－Ｓ１７２－Ｇ１７３－Ｇ１７４）之中［９５］。逡逑圖１－９邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ結構示意圖逡逑巧ｇ．邋１－９邋Ｃｒｙｓｔａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ逡逑ＰｈｅｌｉＳｓ／逡逑^6逡逑＾邐Ｓｅｒ１７１逡逑Ａｌａ１９５邋巧邋ｅｒ１９邋巧、邐、逡逑Ｌｙｓ９６邋／逡逑圖１－１０邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ的活性中屯及與底物結合方式逡逑Ｆｉｇ．邋１－１０邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ａｃｔｉｖｅ邋ｓｉ化邋ｏｆ邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ逡逑１２逡逑
【學位授予單位】：南京農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：X592;X172

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本文編號：2606536