胃腸道感染病毒是除細菌之外的引起胃腸道疾病的主要病原體之一，通過接觸娛樂用水或食用被污染的貝類感染人體。這類病毒主要來源于人畜糞便等排泄物污染的生活污水，在各種水環(huán)境中普遍存在，并且存活時間長，感染劑量低，可以通過娛樂用水或食用海產(chǎn)品感染人類。因此，建立其快速、高效的檢測技術(shù)，對于水傳播疾病的預防和控制是迫切需要的。然而目前尚沒有一種同時確定其感染性和快速定量的方法，給人體健康風險評估帶來了很大的障礙。因此，本論文從這一點出發(fā)，開展了以下相關的工作。 選取具有指示作用的胃腸道感染病毒—腸道病毒(EV)和感染性最強的胃腸道感染病毒—輪狀病毒(RV)為指示微生物，實現(xiàn)以下目標：1.建立快速定量水環(huán)境中具有感染性病毒濃度的方法，同時探討不可培養(yǎng)病毒的病原性檢測方法；2.將此方法在渤海灣天津海域進行了應用與可行性分析；3.通過探討病毒在海洋環(huán)境中的存活時間和滅活機理，對病毒感染人體的健康風險進行了實際評估。 主要研究內(nèi)容和研究成果如下： 1.分別建立了腸道病毒代表種脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV)和RV的細胞培養(yǎng)結(jié)合實時定量PCR(ICC-qPCR)檢測方法，克服了細胞培養(yǎng)和實時定量PCR技術(shù)單獨作用時...

【文章頁數(shù)】：154 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

圖2.1Vero細胞形態(tài)（×100），（a）：正常Vero細胞；（b）：病變Vero細胞

圖2.1Vero細胞形態(tài)（×100），（a）：正常Vero細胞；（b）：病變Vero細胞2.2.4.2空斑法測定病毒滴度致細胞病變的病毒，能夠在固態(tài)瓊脂培養(yǎng)基覆蓋下的細胞單層中形成肉可見的空斑，通過計數(shù)形成空斑的數(shù)量可準確地測定病毒滴度[96]。操作過程為1）接....

圖2.2PV1在Vero細胞上形成的空斑（稀釋106倍）

.2PV1在Vero細胞上形成的空斑（稀釋10real-timePCR方法的建立erPrimier5.0，根據(jù)脊髓灰質(zhì)炎度保守區(qū)5′UTR設計引物（PqF/PqRst功能檢測引物和探針的特異性；R設計實時定量PCR（real-timePCR）....

圖2.3脊髓灰質(zhì)炎病毒電泳圖，其中（a）為構(gòu)建質(zhì)粒的擴增片段（M：DL2000Marker；

擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，結(jié)果如圖2.3（d）所示。（a）（b）（c）（d）圖2.3脊髓灰質(zhì)炎病毒電泳圖，其中（a）為構(gòu)建質(zhì)粒的擴增片段（M：DL2000Marker；1：陰性對照；2：目的片段）；（b）連接后載體引物擴增片段（M：Marker；1-5泳道為連接片段）；（c....

圖2.4腸道病毒實時定量PCR標準曲線（a）和擴增曲線（b）

斜率為-3.407（有效范圍-3.5≤斜率≤-3.0），E=95.5﹪，各項參數(shù)指標良好，并且穩(wěn)定性高，陰性對照無產(chǎn)物擴增，可以作為后續(xù)的標準曲線（圖2.4（a））。（1）靈敏度測試將標準品按10倍梯度稀釋，至終濃度為1.0×100～1.0×109拷貝數(shù)/μL，分別取1μL為模....

本文編號：3997093