發(fā)布時間：2020-11-10 10:44

　　 臍帶間充質干細胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,UCMSCs)是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞。UCMSCs具有來源豐富、不涉及倫理道德、低免疫原性、體外擴增能力強及能分化為多種體細胞等特征,因此,UCMSCs的相關研究備受關注。目前,已成功從人、大鼠、兔、豬等動物分離獲得臍帶間充質干細胞,但與其相比,關于綿羊臍帶間充質干細胞(sheep Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,sUCMSCs)的分離、培養(yǎng)及定向分化等研究的相關報道甚少。綿羊是基礎生物學及畜牧學等研究領域的重要大動物模型。據此,本研究在改良sUCMSCs分離及培養(yǎng)體系的基礎上,探討了誘導sUCMSCs為誘導多能性干細胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)的同時將sUCMSCs定向誘導分化為成肌細胞并初步探究其在體內修復損傷組織的作用機制。本研究主要研究結果如下:1.建立了組織塊二次貼壁分離綿羊臍帶間充質干細胞的方法,并用改良的無血清體系在體外擴增培養(yǎng)獲得了綿羊臍帶間充質干細胞,經鑒定,所獲得的sUCMSCs的免疫表型在高表達CD90、CD105及CD44(表達量在95%以上)的同時,低表達CD45、CD34及CD14(表達量在2%以下)。此外,組織塊二次貼壁法獲得的sUCMSCs可在體外傳至12代,并且能向成骨、成脂及成軟骨細胞方向分化。2.采用Yamanaka的OSKM四因子方法誘導sUCMSCs為iPSCs,獲得了類胚胎干細胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)的克隆樣細胞,對其進行堿性磷酸酶染色鑒定,結果顯示克隆呈棕紅色的陽性結果;此外,對所獲得的克隆進行多能性因子表達情況的檢測,結果發(fā)現,克隆表達多能性因子OCT-4、SSEA-4、Nanog及TRA-1-81;為檢測獲得的sUCMSCs來源的克隆在體內分化能力,將克隆制備成單細胞懸液后注射免疫缺陷小鼠腋下,在注射后第4周采集畸胎瘤制成石蠟切片后進行HE染色,在倒置顯微鏡下可觀察到肌肉、毛囊、腺體等三個胚層的組織。3.采用5-氮雜胞苷聯合馬血清法,誘導sUCMSCs分化為成肌細胞,檢測分化不同時期成肌細胞標志蛋白Desmin、MyHC及MyoD與標志分子Desmin、Myf5及MyoG的表達情況;此外,將sUCMSCs、分化第14天的成肌細胞及絲裂霉素C處理的sUCMSCs移植入肌肉損傷模型小鼠的脛骨前肌,在移植細胞后不同時間經石蠟切片并HE染色,檢測小鼠損傷的肌肉的修復情況。結果顯示:(1)在5-氮雜胞苷及馬血清的聯合作用下,sUCMSCs在誘導分化第3天Myf5基因開始表達;第7天個別細胞形態(tài)發(fā)生改變,呈桿狀、多角狀,細胞增殖減緩,且成肌細胞標志蛋白Desmin、MyHC及MyoD均有表達,有部分細胞發(fā)生融合;在分化第14天Desmin及MyoG基因表達量升高,細胞增殖持續(xù)減緩,融合細胞增多,且融合后的細胞內細胞核增多;在分化的第21天Desmin基因表達量驟升,且細胞代謝產物增多,出現肌管樣結構;(2)在細胞移植后,sUCMSCs組小鼠損傷肌肉后第2天即進入修復期,在第10天肌纖維排列致密,彼此融合,損傷肌肉基本恢復正常;成肌細胞組小鼠損傷肌肉第3天即進入修復期,在第14天肌纖維排列致密,彼此融合,損傷肌肉基本恢復正常;絲裂霉素C組及對照組小鼠損傷肌肉在第2-3天進入修復期,且在第10天損傷肌肉未能完全修復,肌纖維之間仍存在明顯的空隙,第14天肌肉也未能完全恢復正常。綜上所述,采用二次貼壁法及無血清培養(yǎng)體系可獲得形態(tài)及體外增殖能力正常、且表達間充質干細胞表面標志分子并具有多向分化潛能的sUCMSCs。所獲得的sUCMSCs不僅能誘導為iPSCs,而且可分化為對小鼠損傷肌肉有修復功能的成肌細胞。本研究為建立完善的綿羊誘導多能干細胞技術及探明間充質干細胞的定向分化及修復機制提供科學依據。
【學位單位】：東北林業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q2-33
【部分圖文】：

?傳統(tǒng)組織塊貼壁法，使用基礎培養(yǎng)基（含ＦＢＳ）培養(yǎng)４８ｈ即貼壁４天可見呈長梭形的??細胞爬出（圖２．１ａ），９天左右細胞融合度可達９０％?（圖２．１ｂ）；使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的組??織塊同樣４８ｈ貼壁４天可見呈長梭形的細胞爬出（圖２．１ｃ），１０天左右細胞融合度可達９０％??（圖?２．１ｄ）。??二次貼壁法，使用基礎培養(yǎng)基（含ＦＢＳ）培養(yǎng)２４ｈ即可見組織塊貼壁，２天細胞即爬出??（圖２．１ｅ），６天左右細胞融合度可達９０％?（圖２．１ｆ）；使用無血清培養(yǎng)基２４ｈ可見組織塊貼??壁，２天可見細胞爬出（圖２．?ｌｇ），?６天左右細胞融合度可達９０％?（圖２．?ｌｈ）。??４組細胞在貼壁伸展后均呈長梭形，待細胞融合度達８５％時，排列緊密，呈渦旋狀或指??紋狀，上述結果表明與傳統(tǒng)組織塊貼壁法相比，二次貼壁法的組織塊貼壁更快，細胞爬出時??間更短，且能將有限的材料在短時間內充分利用并獲取數量加倍的細胞。此外，通過比較含??血清的基礎培養(yǎng)基與無血清培養(yǎng)基分離原代細胞的結果發(fā)現

養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞使用Ｔｉｙｐｓｉｎ，而無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞使用ＴｒｙｐＬＥ）將４組綿羊臍帶間??充質干細胞進行消化傳代擴增。??４組綿羊臍帶間充質干細胞的Ｐ３代細胞增殖速度一致，３ｄ融合度均可達８５％?（圖２．２??ａ，ｃ，ｅ，ｇ），且細胞排列緊密，呈指紋狀，細胞形態(tài)均一，細胞呈成纖維細胞樣貼壁生??長，細胞飽滿，細胞核大，胞衆(zhòng)透明無雜質，而Ｐ１２代細胞在３＞４ｄ內融合度也可達８５％，??細胞形態(tài)正常，與Ｐ３代細胞相似，呈長梭形旋禍狀貼壁生長（圖２．２?ｂ，ｄ，ｆ，ｈ）。上述結??果表明，二次貼壁法獲得的細胞與傳統(tǒng)的貼壁法獲得的細胞在傳代培養(yǎng)后細胞生長速度一??致，細胞形態(tài)及狀態(tài)無明顯差異，無血清培養(yǎng)基并未因缺乏ＦＢＳ而對細胞造成不良影響，??傳代后的細胞形態(tài)及生長狀態(tài)與含ＦＢＳ培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞無明顯差異

?臺期，分別比較４組細胞Ｐ３及Ｐ１２代細胞的增殖能力發(fā)現，（１）傳統(tǒng)貼壁法，間充質干細??胞基礎培養(yǎng)基與無血清培養(yǎng)基獲得的Ｐ３代細胞的増殖能力均強于Ｐ１２代細胞（圖２．３?ｂ，??ｄ）；?（２）二次貼壁法，間充質干細胞基礎培養(yǎng)基與無血清培養(yǎng)基獲得的獲得Ｐ３代細胞的增??殖能力均較Ｐ１２代細胞強（圖２．３?ｃ，?ｅ）。上述結果說明，組織塊二次貼壁法獲得的綿羊臍??帶間充質干細胞的增殖能力與傳統(tǒng)組織塊貼壁法獲得的細胞無顯著差異，此外，無血清培養(yǎng)??體系培養(yǎng)的細胞的增殖能力與含ＦＢＳ的培養(yǎng)基獲得的細胞也無明顯差異，但是Ｐ１２代細胞??的增殖能力比Ｐ３代細胞略低。??ａ?ｂｅ??２．〇ｉ??？１５＿?＾?ｊ??匕?１．０－??????
【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 邵偉;秦小惠;古再麗;況玲;余雄;;綿羊臍帶間充質干細胞的分離、體外培養(yǎng)及誘導分化[J];新疆農業(yè)大學學報;2012年04期

2 張勇;鄒仲敏;郭朝華;周進明;王勁;羅成基;程天民;;間充質干細胞經MyoD轉染誘導為成肌細胞后對肌損傷的修復作用[J];解放軍醫(yī)學雜志;2008年11期

相關碩士學位論文 前1條

1 宋紅衛(wèi);利用綿羊多能性因子誘導小鼠體細胞為多能性干細胞[D];東北林業(yè)大學;2016年

本文編號：2877840