發(fā)布時(shí)間：2024-06-23 11:01

　　將Cpf1核酸酶N端166個(gè)氨基酸的DNA編碼序列克隆至pET-28a(+)質(zhì)粒中,在大腸桿菌BL21中進(jìn)行重組表達(dá),對(duì)誘導(dǎo)其表達(dá)的IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間開(kāi)展條件優(yōu)化。利用6×His純化標(biāo)簽得到的重組蛋白作為抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫,間接ELISA方法測(cè)定免疫后抗血清效價(jià)達(dá)到128 000,并經(jīng)Protein A純化后得到抗體,Western Blot分析抗體的特異性,結(jié)果顯示可以特異性識(shí)別大腸桿菌中表達(dá)的Cpf1~((1-166))和Cpf1,為Cpf1在生物體中的檢測(cè)提供工具,且將為推動(dòng)CRISPR/Cpf1系統(tǒng)在生物體中的應(yīng)用奠定良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株、質(zhì)粒和動(dòng)物
        1.1.2 主要試劑
        1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    1.2 方法
        1.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        1.2.2 Cpf1(1-166)在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的條件改良
        1.2.3 融合蛋白6×His-Cpf1(1-166)的純化
        1.2.4 多克隆抗體的制備
        1.2.5 ELISA法測(cè)定效價(jià)
        1.2.6 抗血清的純化
        1.2.7 SDS-PAGE和Western Blot分析
2 結(jié)果與分析
    2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
    2.2 Cpf1(1-166)在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的條件改良
    2.3 重組蛋白的純化及Western Blot分析
    2.4 ELISA測(cè)定抗血清效價(jià)
    2.5 多克隆抗體的特異性檢測(cè)
3 討論與結(jié)論



本文編號(hào)：3995367