發(fā)布時間：2020-11-20 18:15

　　 嬰兒出生時腸道發(fā)育尚未成熟,腸道免疫發(fā)育緩慢,這種腸道發(fā)育不成熟使得他們更容易感染各種病癥,如壞死性小腸結腸炎等。母乳含有多種生物活性成分,有助于嬰兒腸道正常生長和發(fā)育,其中一種重要的組分是乳鐵蛋白。乳鐵蛋白(lactoferrin,LF)在經(jīng)消化道酶水解作用下會釋放具有生物活性的肽段——乳鐵蛋白素(lactoferricin,Lfcin)。研究表明,乳鐵蛋白具有抵抗真菌和病菌感染、減緩炎癥反應、抗癌及提高機體的免疫調節(jié)的能力,尤其在促進腸道免疫方面具有顯著作用。現(xiàn)階段包括我國在內(nèi)的許多國家均已將乳鐵蛋白作為嬰兒配方奶粉的重要添加組成分。近兩年,巴氏殺菌奶開始進入我國消費者視線,以其最大程度保持了鮮奶的營養(yǎng)、風味及生物活性成分等特點越來越受到人們的關注。探究不同熱處理條件對乳鐵蛋白免疫活性的影響,確立保持乳鐵蛋白生物活性的最佳巴氏殺菌參數(shù),并探討其有效提高嬰兒免疫力的劑量,為現(xiàn)代乳制品加工技術更科學和精準的發(fā)展提供新證據(jù)。本研究以鮮牛乳來源的乳鐵蛋白(bovine lactoferrin,bLF)為原料,通過體外細胞實驗,探究乳鐵蛋白對大鼠小腸隱窩上皮細胞(IEC-6)在增殖、周期、凋亡和周期相關基因表達等方面的影響,以此確定在體外環(huán)境下,乳鐵蛋白的最佳熱處理條件及劑量范圍。根據(jù)體外實驗所得數(shù)據(jù),結合母乳常乳中乳鐵蛋白的含量,選定恰當?shù)母咧械蛣┝?灌胃SD雄性大鼠,通過血液免疫和腸道免疫各項指標評估,探究最佳熱處理條件對乳鐵蛋白免疫活性的影響。確定適當?shù)募庸すに嚰疤砑臃秶�。實驗結果表明:(1)在體外細胞實驗中,巴氏殺菌后牛乳鐵蛋白均可通過增加IEC-6細胞與周期相關基因cyclin B1、CDK1和cyclin E1的表達水平,降低p21的表達水平,從而調節(jié)細胞周期分布,增加IEC-6細胞在G_2/M期和S期的分布,降低細胞在G_0/G_1期的分布,促進IEC-6細胞增殖,減緩細胞凋亡。72℃/15s和85℃/15s均可最大化保留乳鐵蛋白的免疫活性,體外促進嬰兒腸道免疫的最佳劑量為0.1 mg/mL。(2)在動物灌胃實驗中,兩種處理方式下(未經(jīng)熱處理和85℃/15s)的牛源乳鐵蛋白均對血液免疫和腸道免疫具有調節(jié)作用,可增強機體免疫。乳鐵蛋白可以增加大鼠血清中IL-2、IL-4、IFN-γ、IgM的分泌量,上調大鼠血清中IFN-γ/IL-4比值,維持Th1和Th2型細胞因子的動態(tài)平衡。通過降低大鼠血清中DAO的活性,增加大鼠結腸中sIgA分泌量,增加大鼠結腸Occludin與ZO-1基因的表達量,乳鐵蛋白能夠降低大鼠腸粘膜通透性,提高大鼠腸道屏障功能和免疫功能;(3)綜合血液免疫和腸道免疫各項指標表明,85℃/15s的熱處理方式對乳鐵蛋白的免疫活性基團無顯著破壞作用,灌胃劑量60 mg/kg·BW免疫調節(jié)效果最佳。巴氏滅菌雖可部分損傷乳鐵蛋白的免疫活性基團,但不能使其生物活性降低。巴氏殺菌85℃/15s是保留生鮮乳中免疫蛋白免疫活性的最佳殺菌條件。(4)隨著灌胃時間的增加,調節(jié)作用更加顯著。表明乳鐵蛋白對于機體的免疫調節(jié)作用是一個長期的過程。巴氏殺菌85℃/15s是保留生鮮乳中免疫蛋白免疫活性的最佳殺菌條件,這為現(xiàn)階段乳制品加工工藝參數(shù)設計以及營養(yǎng)補充劑添加量提供理論依據(jù),同時又引導了國內(nèi)本土生鮮奶產(chǎn)品的發(fā)展方向。
【學位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TS252.1
【部分圖文】：

東北農(nóng)業(yè)大學工學碩士學位論文果與分析體外細胞實驗結果 巴氏殺菌后的牛源乳鐵蛋白水解液對 IEC-6 細胞增殖的影響照實驗設計，根據(jù)母乳常乳中的乳鐵蛋白含量 1 g/L 為上限，實驗初期濃度選 mg/mL 中幾個關鍵點濃度，進行嘗試。結果顯示細胞增殖濃度以 0.1 mg/mL 為分小于 0.1 mg/mL 時，細胞增殖率逐漸增大，當濃度大于 0.1 mg/mL 時，細胞增趨勢。最終選定最佳濃度范圍為 0-0.1 mg/mL，選擇幾個關鍵點濃度進行試驗圍下培養(yǎng) 24 和 48 h 細胞增殖率，24 h 細胞增殖情況結果如圖 3-1 所示。

*與相應濃度下未熱處理乳鐵蛋白組比較，差異顯著（P＜0.05）圖 3-2 不同濃度乳鐵蛋白水解液刺激 IEC-6 細胞 48 h 細胞增殖情況Figure 3-2 Effects of lactoferrin hydrolyzate after pasteurization on proliferationof IEC-6 cells for 48 h圖 3-1 和 3-2 所示結果，4 種處理條件下的乳鐵蛋白，刺激 IEC-6 細胞 24 和 48大致相同。隨著乳鐵蛋白水解液濃度的升高，IEC-6 細胞增殖率逐漸升高，且在濃度為 0.1 mg/mL 時，細胞的增殖率達到最大。當濃度在 0.1 mg/mL 以上時降趨勢。同巴氏殺菌條件對 IEC-6 細胞增殖影響方面，與未熱處理的牛源乳鐵蛋白水解 63℃/30min 外，其他 2 種加熱處理方式對乳鐵蛋白的免疫活性沒有顯著地5），尤其是 85°C/15s 的巴氏殺菌方式，細胞培養(yǎng) 48 h 后，基本與未熱處理的牛殖 IEC-6 細胞效果持平，在水解液濃度為 0.02 mg/mL 和 0.08 mg/mL 條件下，處理組。由此可知，巴氏殺菌并沒有使乳鐵蛋白的免疫活性基團完全失活，4 的乳鐵蛋白水解液最佳增殖劑量均為 0.1 mg/mL。巴氏殺菌后的牛源乳鐵蛋白水解液對 IEC-6 細胞周期的影響實驗設計，采用最佳細胞增殖濃度 0.1 mg/mL 的 4 種處理方式下的乳鐵蛋白水

圖 3-3 不同巴殺條件下的乳鐵蛋白水解液刺激 IEC-6 細胞 24 h 周期圖例Figure 3-3 Cell cycle legends of lactoferrin hydrolysate under different pasteurizationconditions stimulated IEC-6 cell for 24 h驗采用濃度為 0.1 mg/mL 的牛鮮乳來源乳鐵蛋白水解液作用 IEC-6 細胞 24 h 后行流式檢測。結果如表 3-1 所示。表 3-1 濃度為 0.1 mg/mL 的乳鐵蛋白水解液作用 24 h 對 IEC-6 細胞周期的影響ble 3-1 Effects of 0.1 mg/mL lactoferrin hydrolysate under different pasteurization oncycle of IEC-6 cells for 24 h處理條件 細胞周期（%）G0/G1G2/M+S空白組 85.84±3.52a14.16±3.53d未熱處理組 61.44±2.54d38.56±2.54a63℃/30min 71.28±1.57b28.72±1.56c72℃/15s 67.80±1.96bc32.20±1.97bc85℃/15s 63.80±1.80cd36.20±1.80ab小寫字母不同，表示各組差異顯著（P＜0.05）。
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本文編號：2891802