發(fā)布時間：2020-11-19 17:38

　　 葡萄(Vitis vinifera L.)是世界范圍內(nèi)一種重要的果樹作物。我國北方葡萄主產(chǎn)區(qū)冬季寒冷干旱,主栽的歐亞種抗寒旱性較差,需要埋土才能安全越冬。此外,晚霜或早霜等低溫引起的冷害和凍害也造成葡萄新芽和嫩枝的傷害,從而影響葡萄果實的品質(zhì)與產(chǎn)量。因此,深入研究葡萄抗寒旱的分子機理,對培育抗寒旱的葡萄新品種,具有重要的理論和實際意義。前期研究發(fā)現(xiàn),葡萄中多個WRKY基因能夠快速響應(yīng)低溫脅迫,表明它們可能參與了葡萄的抗寒調(diào)控。本研究以高抗的山葡萄為材料,克隆了VaWRKY12,對其在不同脅迫條件下的表達模式及亞細胞定位進行了分析,并通過在擬南芥和山葡萄愈傷組織中過表達VaWRKY12,對其抗性功能及可能調(diào)控的下游基因進行了研究。同時,通過構(gòu)建酵母雙雜交文庫篩選可能與VaWRKY12互作的蛋白。此外,本研究同時克隆了VaWRKY14基因,分析了其在不同脅迫下的表達模式與亞細細胞定位,并通過在擬南芥中過表達VaWRKY14分析其抗性功能及下游調(diào)控。取得的主要研究結(jié)果如下:1、在山葡萄中克隆了VaWRKY12基因,序列分析結(jié)果顯示VaWRKY12蛋白含有一個完整的WRKY結(jié)構(gòu)域,其C端含有一個C_2H_2鋅指結(jié)構(gòu),屬于WRKY IIb亞家族。VaWRKY12能夠響應(yīng)低溫脅迫,隨著冷處理時間的延長表達量持續(xù)上調(diào),同時VaWRKY12能夠不同程度地響應(yīng)外源ABA、SA和GA的處理。2、VaWRKY12蛋白序列C端含有一段跨膜區(qū)(TM)。利用擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和煙草瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進行研究表明,正常條件下VaWRKY12全長蛋白同時分布在細胞質(zhì)和細胞核,在低溫及其他脅迫條件下全部定位在細胞核,而去掉TM區(qū)的VaWRKY12截短蛋白在正常條件下全部定位于細胞核。由此可以推論,TM區(qū)影響VaWRKY12在細胞內(nèi)的定位,脅迫后VaWRKY12可能會向細胞核轉(zhuǎn)移。3、構(gòu)建了基于35S啟動子的VaWRKY12過表達載體,過表達VaWRKY12后擬南芥植株的抗寒性顯著高于野生型。低溫條件下過表達VaWRKY12能夠提高植株中SOD的酶活,降低體內(nèi)活性氧H_2O_2和O_2~-的積累,表明VaWRKY12通過增加植株的抗氧化能力來增強植物的抗寒性。4、過表達VaWRKY12的山葡萄愈傷其抗寒性顯著高于空載對照。低溫處理下過表達VaWRKY12愈傷中大量與脅迫相關(guān)的基因上調(diào)表達,其中包括ROS清除相關(guān)的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)基因和POD基因。這些結(jié)果表明VaWRKY12可能通過影響ROS的清除來調(diào)控葡萄的抗寒性。5、以VaWRKY12為誘餌蛋白進行互作蛋白的篩選,共得到10個候選的互作蛋白,其中包括2個泛素相關(guān)蛋白和2個鈣調(diào)結(jié)合蛋白,這些蛋白可能通過與VaWRKY12的相互作用來調(diào)控葡萄的抗寒性。6、VaWRKY14基因序列分析結(jié)果表明VaWRKY14屬于WRKY IIa亞家族基因。擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)VaWRKY14蛋白定位在細胞核。VaWRKY14能夠響應(yīng)低溫和干旱脅迫及外源SA和ABA的處理。過表達VaWRKY14能夠顯著提高擬南芥的抗旱性。同時,過表達VaWRKY14擬南芥在干旱條件下抗氧化活性(CAT、POD和SOD)高于野生型植株。RNA-Seq結(jié)果顯示過表達VaWRKY14后擬南芥中大量與脅迫相關(guān)基因的表達量上調(diào)。
【學(xué)位單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院武漢植物園)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S663.1
【部分圖文】：

山葡萄中VaWRKY12基因編碼區(qū)的擴增

VaWRKY12蛋白同源性比對與聚類分析

通d習(xí)aftertn:atment(h)
【參考文獻】

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1 范培格;黎盛臣;王利軍;楊美容;吳本宏;段偉;李連生;鐘靜懿;張映祝;文麗珠;張鳳琴;羅方梅;李紹華;;葡萄釀酒新品種北紅和北玫的選育[J];中國果樹;2010年04期

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相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 孫小明;乙烯響應(yīng)因子ERF057和ERF080調(diào)控葡萄抗寒性的機理研究[D];中國科學(xué)院研究生院(武漢植物園);2016年

本文編號：2890273