發(fā)布時間：2020-11-19 16:21

　　 植物中可溶性糖——包括蔗糖、葡萄糖和果糖,不僅作為信號物質(zhì)調(diào)控著成千上萬基因的表達,影響著植物生長、發(fā)育及對逆境的抗性,也調(diào)控著胞內(nèi)滲透勢、膨壓和氧化還原勢,且可溶性糖的種類和組成也會影響蘋果等水果的品質(zhì)。蘋果作為薔薇科代表果樹,由于其長距離運輸?shù)耐�化物以山梨醇為�?山梨醇在庫細胞中全部轉(zhuǎn)化為果糖進入碳代謝。因此,與其它植物相比,蘋果中具有更高效的果糖利用能力。探明蘋果中果糖高效代謝利用的調(diào)控機制,對于果實品質(zhì)的改良和生長發(fā)育的調(diào)控有重要意義。為此,本文結合蘋果基因組篩選了在庫細胞中高度表達的果糖代謝相關的果糖激酶基因MdFRK2,研究了其表達及催化特性,獲得了轉(zhuǎn)基因蘋果等,研究了其在糖代謝調(diào)控中的功能。獲得的主要結果如下:1.在蘋果基因組中共鑒定到了12個MdFRK同源基因,其中MdFRK2與番茄高親和力果糖激酶LeFRK2親緣關系最近,其ORF全長990bp,編碼330個氨基酸,屬于pfkB家族,并且含有FRK特有的糖結合域和ATP結合域。表達分析顯示,MdFRK2基因主要定位于細胞質(zhì)中,在蘋果莖尖、幼果等代謝活躍的庫器官中高度表達,與果實發(fā)育過程中果糖的含量呈顯著負相關。為研究其催化特性,純化獲得了在大腸桿菌中異源表達的MdFRK1和MdFRK2蛋白,活性分析表明,二者對果糖有高度的底物特異性,且活性受高濃度果糖的反饋抑制。對其動力學酶活性研究發(fā)現(xiàn),MdFRK2蛋白(Km=0.1 mm)對果糖的親和力顯著高于MdFRK1蛋白(Km=0.62 mm),但二者有相似的最大催化活性。這些結果表明,蘋果中果糖的高效利用與MdFRK2的高度表達及對果糖高的催化能力有關。2.為了證實MdFRK2基因?qū)μO果果糖含量及糖代謝路徑的影響,構建了植物過表達載體,利用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化‘嘎啦’蘋果,經(jīng)分子和酶活性鑒定,獲得了3個MdFRK2基因過表達的陽性轉(zhuǎn)基因植株,其MdFRK2的mRNA和蛋白表達量均顯著上調(diào),且FRK酶活性增加。在培養(yǎng)箱種植的3月齡的轉(zhuǎn)基因植株的凈光合速率和生長與野生型無明顯區(qū)別。對糖含量的測定發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因蘋果苗葉片中不僅果糖含量顯著降低,且葡萄糖、蔗糖的含量均低于野生型植株。對其蔗糖含量下降原因的研究表明,轉(zhuǎn)基因蘋果中果糖代謝加快后,山梨醇合成關鍵酶A6PR及代謝的關鍵酶SDH酶活顯著增加,而蔗糖合成關鍵酶SPS及代謝關鍵酶NINV和SUSY酶活顯著降低,導致蔗糖和葡萄糖含量降低。這些結果表明MdFRK2基因調(diào)控蘋果中果糖的含量,且蘋果葉片能通過改變山梨醇和蔗糖代謝調(diào)控糖的含量。同時,對MdFRK2過表達的轉(zhuǎn)基因番茄的研究也表明,MdFRK2過表達增加了番茄果實中FRK的活性,降低了果糖、葡萄糖和蔗糖的含量。3.由于MdFRK2過表達的轉(zhuǎn)基因蘋果中的糖含量變化趨勢與褪黑素處理的苗子中糖含量變化趨勢相反,我們推測MdFRK2表達與褪黑素信號之間存在密切的關聯(lián)。為探明FRK2表達與褪黑素介導的糖積累之間的關系,我們用褪黑素處理野生型和MdFRK2過表達的轉(zhuǎn)基因蘋果苗。研究發(fā)現(xiàn),高濃度褪黑素處理后,野生型蘋果苗葉片中MdFRK2的轉(zhuǎn)錄和FRK活性受到抑制,果糖、葡萄糖和蔗糖含量顯著增加,苗子生長受到抑制。在煙草葉片中瞬時轉(zhuǎn)化MdFRK2基因啟動子也證實MdFRK2的表達受高濃度褪黑素的抑制。但高濃度的外源褪黑素處理MdFRK2轉(zhuǎn)基因苗并不能引起葉片中果糖、葡萄糖及蔗糖的大量積累,苗子的生長也沒有受到明顯抑制。以上結果表明MdFRK2基因表達參與了高濃度褪黑素介導的糖積累和生長抑制效應。4.將培養(yǎng)箱中的轉(zhuǎn)基因蘋果小苗移栽至溫室一年后,再次測定糖含量發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因蘋果苗葉片中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量不但沒有下降,反而顯著升高。進一步分析表明,轉(zhuǎn)基因蘋果葉片中MdFRK2表達仍然增加了24-45倍,但FRK活性表現(xiàn)出顯著下調(diào)趨勢,參與糖代謝的關鍵基因表達(如MdSDH1,MdSPS1,MdSUSY2)和酶活性(如SDH,SPS和SUSY)表現(xiàn)出與幼苗期完全相反的變化趨勢。這些結果表明MdFRK2蛋白發(fā)生了翻譯后修飾,且進一步證實了由MdFRK2決定的FRK活性調(diào)控著細胞內(nèi)的糖信號以及代謝。我們通過高通量測序?qū)�轉(zhuǎn)基因蘋果中果糖恢復穩(wěn)態(tài)的調(diào)控機制進行研究,轉(zhuǎn)基因蘋果中存在的差異表達基因共477個,包括41個蛋白質(zhì)水平調(diào)控相關的基因,這些蛋白功能的進一步解析有望探明蘋果中果糖信號的調(diào)控機制。
【學位單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S661.1
【部分圖文】：

FRKs 可能和植物應對非生物脅迫響應相關。在玉米中，短期的鹽 FRK2 基因表達上調(diào)（Zorb et al. 2010）；在向日葵中，干旱脅迫導致 FRK 蛋謝相關的蛋白表達共同上調(diào)（Fulda et al. 2011）；甜菜根中，F(xiàn)RK 活性隨著長而增加（Klotz et al. 2006）；在缺氧的條件下，水稻的兩個 FRK 同工酶卻活性，其中 OsFRK2 表達上調(diào)，但是 OsFRK1 表達下調(diào)（Guglielminetti et al. 2（2016）研究山梨醇和蔗糖在蘋果抵抗干旱脅迫中的作用發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下中與糖代謝有關的大部分基因表達量上調(diào)，其中包括 MdFRK2 基因。 蘋果中糖代謝研究進展.1 蘋果糖代謝特點蘋果中光合產(chǎn)物主要以山梨醇形式存在，約占總光合產(chǎn)物的 80%左右，其次約占總光合產(chǎn)物的 20%（圖 1-1）。這兩種物質(zhì)在源葉中合成后，一部分用于所需的碳骨架，一部分作為代謝底物被氧化分解提供能量，其余大部分通過管-伴胞復合體運輸?shù)焦麑崱⑶o尖等庫器官中進行代謝（圖 1-2，鄧麗莉和生; Li et al. 2016）。

圖 1-2 蘋果庫器官中的糖代謝及利用途徑（Li et al. 2012）Fig. 1-2 Metabolism and utilization of carbohydrate in apple fruit.醇代謝山梨醇廣泛存在于葉片、葉柄、韌皮部、莖、根、種子和果實其在成熟葉片中含量非常高，而在果實中含量遠低于葉片，僅Josef 2004）。葉片中高的山梨醇含量有利于向果實中的轉(zhuǎn)運，果葡萄糖濃度是由于葉片中山梨醇的轉(zhuǎn)運導致（梁東 2010）。光合碳代謝形成的磷酸丙糖被位于葉綠體被膜上的磷酸丙糖轉(zhuǎn)運，并經(jīng)過幾種酶解后生成果糖-1,6-二磷酸（FBP），胞質(zhì)中的FBPase）催化果糖-1,6-二磷酸分解為 6-磷酸果糖（Fructose-6-p酸。6-磷酸果糖可逆的轉(zhuǎn)化為 6-磷酸葡萄糖（Gucrose-6-phospha糖在 6- 磷酸山梨醇脫氫酶（ S6PDH ）的催化下生成 6- 磷phosphate，S6P），而后經(jīng) 6-磷酸山梨醇磷酸酯酶（Sorbitol-6SorPP）脫磷生成山梨醇（梁東 2010; Zhou et al. 2004; Aprea et a成的大部分山梨醇經(jīng)過長距離運輸?shù)綆炱鞴僦羞M行卸載。在蘋

9 MdFRK 蛋白活性檢測測定方法參照 Renz（1993），1 ml 的反應體系包括 50 mM Tris-HCl（pH 8.0MgCl2， 2.5 mM ATP ， 0.33 mM NAD+， 1 U G6P dehydrogenase ，phoglucoisomerase，25 μL 純化蛋白，最后加入 200 ul 不同濃度（0-8 mM）的反應。30℃水浴 5 min，340 nm 下測定吸光值。 結果與分析1 MdFRK2 基因的克隆和序列分析利用前人報道的番茄 LeFRK2 序列在蘋果基因組數(shù)據(jù)庫中搜索，與其同源度列編號為 MD04G1042400。據(jù)此，本試驗克隆了 MD04G1042400 的開放閱RF），命名為 MdFRK2。通過 DNAMAN 軟件將測序結果與蘋果基因組中預序列進行核酸序列比對，其一致性高達 95.93%，表明克隆到的基因即為正RK2 基因（圖 2-1）。MdFRK2 基因的 ORF 全長 990 bp，編碼 330 個氨基酸殘?zhí)O果基因組的第 0 號染色體上，含有 4 個外顯子和 3 個內(nèi)含子，全長 3124 b。
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本文編號：2890218