發(fā)布時間：2020-11-18 03:00

　　 對蝦病毒性偷死病(viral covert mortality disease,VCMD)和急性肝胰腺壞死病(acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)是近年來出現(xiàn)的兩種蝦類新發(fā)疫病,這兩種病害的傳播流行使我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)遭受了嚴重的經(jīng)濟損失。研究證實,蝦類偷死野田村病毒(covert mortality nodavirus,CMNV)和攜帶Pir基因質粒的多種弧菌分別是導致VCMD和AHPND的病原。本論文在對我國四種主要養(yǎng)殖蝦類包括凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦、日本對蝦和羅氏沼蝦感染CMNV狀況進行系統(tǒng)研究的基礎上,又利用分子生物學、組織學和超微病理分析技術對養(yǎng)殖池塘內、池塘周邊野生生物以及來自東海海域的樣品等攜帶和感染CMNV的情況開展了進一步的研究,探討這些物種是否為CMNV的貯存宿主或媒介生物。同時,本論文也嘗試對致急性肝胰腺壞死病副溶血孤菌(Vibrio parahaemolyticus that caused AHPND,VpAHPND)的病原生態(tài)學展開了初步研究,通過套式PCR、組織病理切片和組織原位雜交等實驗技術分析了養(yǎng)殖三疣梭子蟹自然感染VpAHPND后產(chǎn)生的組織病理變化,并研究了對蝦養(yǎng)殖池塘內及周邊環(huán)境中VpAHPND的貯存宿主或媒介生物。1)針對池塘養(yǎng)殖蝦類中CMNV的流行情況開展了調查研究:逆轉錄巢式PCR檢測顯示,從患病對蝦樣品總RNA中能夠擴增出與預期大小一致的片段,測序結果證實擴增片段序列為CMNV特征基因序列,基于測序片段序列構建的系統(tǒng)進化樹結果也表明上述患病蝦類中CMNV株系與CMNV原始株系親緣關系很近。針對患病凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦、日本對蝦和羅氏沼蝦進行組織病理、原位雜交(in situ hybridization,ISH)和透射電鏡(transmission electron microscopic,TEM)分析,結果顯示,這些蝦類樣品的肝胰腺組織中均可見肝胰腺小管上皮細胞脫落和核固縮,其中凡納濱對蝦和羅氏沼蝦的肌肉組織出現(xiàn)溶解狀壞死、肌纖維間排列疏松等病變,肝胰腺和肌肉的病變組織部位中存在CMNV RNA探針的陽性雜交信號,電鏡分析結果也證實這些樣品的肝胰腺細胞中存在大量散在的CMNV樣病毒顆粒。上述結果說明,發(fā)生VCMD的養(yǎng)殖凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦、日本對蝦和羅氏沼蝦中均存在CMNV感染,感染導致患病個體的肝胰腺和肌肉組織出現(xiàn)了較為嚴重的病理損傷。2)對對蝦養(yǎng)殖池塘內及周邊排水渠中野生水母攜帶和感染CMNV情況進行了調查分析:結果發(fā)現(xiàn),采用逆轉錄巢式PCR方法可從鉤手水母樣品總RNA中擴增出CMNV的目標條帶,而半月水母樣品中無CMNV目標條帶擴增出來,32份鉤手水母樣品中CMNV的陽性檢出率為12.5%;目標條帶測序和序列比對結果表明,陽性擴增片段的序列與CMNV原始株系對應序列的相似性為99%,系統(tǒng)進化樹分析顯示,來自鉤手水母的CMNV與CMNV原始株系聚為一支;組織病理和ISH分析發(fā)現(xiàn),鉤手水母的胃囊、肌肉等組織中均存在不同程度病理損傷,病變組織部位均有明顯的CMNV RNA探針的陽性雜交信號;透射電鏡分析結果證實,在鉤手水母胃囊和肌肉組織中存在大量的CMNV樣病毒顆粒。鉤手水母作為刺胞動物門的一類生物能夠在自然條件下被蝦類CMNV所感染,進一步證實CMNV具有跨物種傳播的能力。3)對2017年-2018年間我國華北沿海省市對蝦養(yǎng)殖池塘內共棲生物中CMNV的感染和流行情況進行了調查研究:在共采集涉及34個物種的100份樣品,另外還從東海海域采集了遠海梭子蟹樣品,對上述樣品的分析結果顯示,分子生物學分析可檢出CMNV陽性的樣品包括凡納濱對蝦蝦苗、刀額新對蝦、沼蝦、蜾贏蜚、黑褐新糠蝦、天津厚蟹、三疣梭子蟹、釘螺、鹵蟲、蛆蟲、鯽魚、鰕虎魚和羅非魚等13個物種,2017年和2018年沿海對蝦養(yǎng)殖池塘共棲生物中CMNV的流行率分別為40.9%和26.8%。逆轉錄巢式PCR檢測和靶基因測序發(fā)現(xiàn),天津厚蟹、中華沙蟹、黑褐新糠蝦、中華蜾贏蜚、鯔蝦虎魚和蟲蛆等樣品均可擴增出CMNV陽性片段,陽性片段序列與CMNV原始株系相應序列的相似性97%以上;系統(tǒng)進化樹分析結果顯示來自上述樣品中的CMNV與CMNV原始株系序列聚為一支,親緣關系較近;病理分析結果顯示,凡納濱對蝦、天津厚蟹、中華沙蟹、沙蠶和遠海梭子蟹樣品的多個組織內存在病理改變,ISH結果表明上述樣品病變組織內存在藍紫色的CMNV探針陽性雜交信號,TEM分析結果證實在凡納濱對蝦、天津厚蟹、中華沙蟹和沙蠶的體內存在大量的CMNV樣病毒顆粒。上述結果表明,CMNV在自然條件下可感染天津厚蟹、中華沙蟹、沙蠶和遠海梭子蟹等野生生物種類,這些種類在CMNV傳播和流行中可能扮演貯存宿主和媒介生物的作用。4)對山東省濰坊市一蝦蟹混養(yǎng)池塘中患病三疣梭子蟹自然感染病原的情況進行了系統(tǒng)分析:采用分子生物學檢測方法對三疣梭子蟹樣品進行了白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)、蝦血細胞虹彩病毒(shrimp hemocyte iridescent virus,SHIV)、VpAHPND、蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)、CMNV、黃頭病毒(yellow head virus,YHV)和肝胰腺細小病毒(hepatopancreatic parvovirus,HPV)等8種病原的檢測,并對樣品進行了組織病理和ISH分析。分子生物學檢測結果顯示,患病三疣梭子蟹樣品呈現(xiàn)VpAHPND陽性,而呈現(xiàn) WSSV、IHHNV、SHIV、EHP、CMNV、YHV 和 HPV 等陰性對樣品VpAHPND套式PCR檢測第二輪擴增產(chǎn)物進行測序、序列比對以及進化樹分析,結果發(fā)現(xiàn)擴增產(chǎn)物與致病副溶血弧菌質粒上pirAvp毒力基因核酸片段具有99%的同源性,該序列與已報道的多個致病副溶血弧菌PirA聚在進化樹的同一主分支上。組織病理學分析顯示,患病三疣梭子蟹的肝胰腺小管上皮細胞壞死,心肌肌纖維呈溶解樣病變,鰓絲上皮柱突細胞壞死明顯,胸中樞神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)細胞損傷嚴重,并且這些組織中還可見大量的細胞核固縮現(xiàn)象;原位雜交結果顯示,肝胰腺、心肌、鰓組織及胸中樞神經(jīng)節(jié)中的病變部位均存在VpAHPND探針的藍紫色雜交信號。以上結果表明,蝦蟹混養(yǎng)池塘中三疣梭子蟹在自然狀態(tài)下感染了VpAHPND,并導致肝胰腺、心肌、鰓和胸中樞神經(jīng)節(jié)發(fā)生了嚴重病理損傷。這是首次在養(yǎng)殖三疣梭子蟹中鑒定到VpAHPND感染并揭示感染所致的病理變化,研究結果為揭示VpAHPND自然宿主種類和養(yǎng)殖三疣梭子蟹病害防控提供了基礎信息。5)為掌握VpAHPND的宿主和媒介生物種類,本研究對采集自凡納濱對蝦、羅氏沼蝦、日本對蝦和三疣梭子蟹養(yǎng)殖場及其周邊的養(yǎng)殖和野生生物種類包括凡納濱對蝦、天津厚蟹、玻璃海鞘、招潮蟹、撓足類和枝角類、沙蠶、蜾贏蜚、石灰蟲、鹵蟲、藤壺等109份樣品進行了檢測,2017年和2018年野生生物中VpAHPND的流行率分別為23.5%和26.7%�；�于套式PCR和熒光定量PCR的分子生物學分析發(fā)現(xiàn),部分凡納濱對蝦、日本對蝦、三疣梭子蟹、天津厚蟹、撓足類和枝角類、蛆蟲呈現(xiàn)VpAHPND的陽性,而蛆蝦、蜾贏蜚、玻璃海鞘、鹵蟲、藤壺、沙蠶等呈現(xiàn)陰性;ISH分析結果顯示,凡納濱對蝦的肝胰腺、天津厚蟹和沙蠶的肌肉組織中存在大量VpAHPND的陽性雜交信號。上述研究表明,養(yǎng)殖池塘中的凡納濱對蝦、養(yǎng)殖池塘周邊排水渠中的天津厚蟹和沙蠶可被VpAHPND感染,后兩者在養(yǎng)殖池塘VpAHPND的傳播和擴散中可能會起到媒介生物的作用。以上研究表明,我國沿海多省市的養(yǎng)殖對蝦包括凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦、日本對蝦和羅氏沼蝦中存在CMNV的感染和流行,對蝦養(yǎng)殖池塘系統(tǒng)中多種生物具有感染、貯存和傳播CMNV的能力,另外CMNV可大幅度跨越物種障礙感染水母,CMNV的這些病原生態(tài)學特征提示出VCMD持續(xù)危害對蝦養(yǎng)殖業(yè)的風險不容忽視。同時本研究有關蝦蟹混養(yǎng)池塘中三疣梭子蟹可被VpAHPND感染并引起嚴重病理損傷,以及池塘中多種生物可被VpAHPND感染的結果表明VpAHPND的有效防控也面臨媒介生物種類多的挑戰(zhàn)。本研究的結果一方面豐富了 CMNV和VpAHPND的病原生態(tài)學內容,另一方面也為開展這兩種新發(fā)疫病的有效防控提供了理論支持。
【學位單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S945.4
【部分圖文】：

第一章 引 言1.1 野田村病毒的研究進展野田村病毒科 Nodaviridae，又稱諾達病毒科，因 Nodamura 病毒（NoV）是該科中首個被鑒定的種而得名，Nov 最初是 1956 年從日本東京附近的野田村采集的三帶喙庫蚊（Culex tritaeniorhynchus）中分離出來[1, 2]。野田村病毒科包含兩個屬[3]：α野田村病毒屬（Alphanodavirus）和β野田村病毒屬（Betanodavirus）。α野田村病毒屬的病毒，主要感染昆蟲，代表種為 Nov[4]。β野田村病毒屬的病毒，目前僅發(fā)現(xiàn)于魚類中，主要可引起魚類病毒性腦病與視網(wǎng)膜病，代表種為條紋鲹神經(jīng)壞死病毒[5]�；�于野田村病毒 RNA 依賴的 RNA 聚合酶（RdRp）氨基酸序列構建的科內病毒成員的系統(tǒng)進化樹參見圖 1-1[6]。

圖 1-2 野田村病毒基因組結構圖[8]Fig.1-2 Genomic organization of nodavirusα 野田村病毒屬屬內病毒成員之間有著相似的物理化學性質，宿主范圍卻相差很大。α 野田村病毒屬中各病毒的原始宿主大多為昆蟲[9]，但該屬內的 FHV 和Nov 卻未見有明顯的宿主特異性，其基因組 RNA 能在昆蟲[10, 11]、脊椎動物[12]、植物[13]和酵母[14]細胞內復制。早期研究表明，Nov 能夠在蚊蟲、虱和蛾幼蟲中復制，但不引起宿主死亡；Nov 經(jīng)媒介生物傳播，可感染并引起幼年小鼠及幼年倉鼠的癱瘓甚至死亡[1]。目前尚未確定脊椎動物中該病毐的自然宿主種類，但在日本的豬體內分離到其高水平的抗體，說明豬對該病毐的感染和傳播可能至關重要[15]。錢東等[4, 16, 17]人通過分析羅氏沼蝦肌肉白濁病典型染病蝦苗，證實了我國發(fā)現(xiàn)的羅氏沼蝦諾達病毒（Macrobrachium rosenbergii nodavirus, MrNV）是導致羅氏沼蝦肌肉白濁病的病原，MrNV 與法屬瓜德羅普島上的諾達病毒之間，具有較大的同源性。羅氏沼蝦諾達病毒主要感染羅氏沼蝦，該病毒感染可引起高達 90%的死亡

圖 2-1 2017-2018 年間四省市養(yǎng)殖蝦類中 CMNV 陽性檢出率情況ig. 2-1 Positive detection rate of CMNV in cultured shrimps in four provinces from 2017 to 2018.2.2 CMNV 陽性分離株系統(tǒng)進化樹分析利用逆轉錄巢式 PCR 方法檢測樣品中 CMNV，部分樣品中能夠擴增出與預期小一致的目的基因條帶，將第二輪 PCR 產(chǎn)物進行膠回收和連接轉化實驗，測序到 RdRp 目的基因片段序列，將測序結果在 NCBI 網(wǎng)站上面比對分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)病蝦的目的基因序列與 CMNV 原始株系 RdRp 目的基因片段的相似性超過 99%，與α野田村病毒屬的其它成員的相似性均在 62%以下；基于陽性樣品中 CMNVdRp 基因推導氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹（圖 2-2 和圖 2-3）發(fā)現(xiàn)，來自發(fā)病對蝦的 CMVN 序列與 CMNV 原始株系的序列聚在一支，與 CMNV 的親緣關系較近，α野田村病毒屬的其它成員親緣關系較遠。
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本文編號：2888258