發(fā)布時(shí)間：2020-11-18 00:35

　　 先天性免疫是宿主抵御病原菌感染的第一道防線,是機(jī)體內(nèi)至關(guān)重要的系統(tǒng)性響應(yīng)元件之一,其不僅可以防止感染和維持生理平衡,還對(duì)激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答至關(guān)重要。在先天性免疫激活的過(guò)程中,炎癥小體通過(guò)激活細(xì)胞焦亡從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)發(fā)生是近年來(lái)被解析的關(guān)鍵信號(hào)。在哺乳動(dòng)物中,炎癥小體主要由三個(gè)組件所組成:Nod樣受體蛋白、接頭蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣顆粒(Apoptosis associated speck like protein containing CARD,ASC)和效應(yīng)蛋白。接頭蛋白ASC在炎癥小體激活過(guò)程中作為該組件的關(guān)鍵的連接分子,主要包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域:PYD結(jié)構(gòu)域和CARD結(jié)構(gòu)域。當(dāng)上游受體蛋白識(shí)別到外源/內(nèi)源性刺激信號(hào)后,可通過(guò)PYD-PYD的同源相互作用來(lái)招募ASC,然后通過(guò)其CARD結(jié)構(gòu)域?qū)�PYD形成的絲狀結(jié)構(gòu)壓縮成斑點(diǎn),并招募pro-caspase-1,誘導(dǎo)IL-1beta和IL-18等炎癥因子的成熟和釋放。然而,在硬骨魚(yú)中,炎癥小體激活介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究,因此,本論文擬以海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚(yú)種大菱鲆為研究對(duì)象,鑒定介導(dǎo)炎癥小體激活的關(guān)鍵組件,并解析其抗細(xì)菌感染分子機(jī)制,尋找有效的關(guān)鍵分子靶標(biāo),為水產(chǎn)養(yǎng)殖魚(yú)類的病害防控提供新思路。本論文以哺乳動(dòng)物上已經(jīng)鑒定的相關(guān)炎癥小體激活分子為基礎(chǔ),通過(guò)RACE技術(shù)克隆得到大菱鲆炎癥小體激活的相關(guān)調(diào)控基因,包括SmGSDME、caspase-3和SmASC。通過(guò)多序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn),不同物種中GSMDE的N端相對(duì)保守,其中大菱鲆的SmGSMDE和大黃魚(yú)的DFNA5親緣最為接近,且在N端具有一段親膜結(jié)構(gòu)域。而caspase-3的序列在整個(gè)生物進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守,且與許氏平鲇caspase-3的親緣關(guān)系最近,其沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域。同時(shí),大菱鲆的ASC和哺乳動(dòng)物的ASC結(jié)構(gòu)高度保守,均具有典型的PYD和CARD結(jié)構(gòu)域,并且,從進(jìn)化角度,其和牙鲆的ASC的親緣關(guān)系最近。鑒于ASC在炎癥小體組件形成過(guò)程中發(fā)揮的重要橋接功能,本論文擬進(jìn)一步探索SmASC的功能。首先,經(jīng)過(guò)表達(dá)SmASC蛋白后,采用DSS交聯(lián)分析發(fā)現(xiàn),SmASC蛋白能夠形成典型的寡聚化特征。其次,在HEK293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SmASC蛋白后,采用免疫熒光分析發(fā)現(xiàn),SmASC蛋白能夠在細(xì)胞內(nèi)形成斑點(diǎn)狀結(jié)構(gòu),并且PYD和CARD結(jié)構(gòu)域在ASC寡聚化過(guò)程中均發(fā)揮了關(guān)鍵作用。然后,進(jìn)一步分析了大菱鲆不同臟器中SmASC的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)其主在肝和肌肉中具有相對(duì)高的表達(dá)。最后,我們通過(guò)細(xì)菌腹腔注射感染發(fā)現(xiàn),鰻弧菌和殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌侵染大菱鲆均能夠誘導(dǎo)SmASC在不同器官中出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá),顯示其在抗細(xì)菌感染過(guò)程中可能發(fā)揮了重要功能。為了進(jìn)一步探索SnASC在抗細(xì)菌感染分子機(jī)制,本論文采用活體注射siRNA對(duì)大菱鲆SmASC進(jìn)行敲降后,通過(guò)殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌腹腔注射感染發(fā)現(xiàn),SmASC敲降魚(yú)體中細(xì)菌的定植顯著增加。其次,采用活體注射SmASC過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后,通過(guò)殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌腹腔注射感染發(fā)現(xiàn),SmASC過(guò)表達(dá)魚(yú)體中細(xì)菌的定植量顯著減少。綜合上述結(jié)果,本論文揭示了SmASC在大菱鲆抗細(xì)菌感染過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用,為進(jìn)一步鑒定大菱鲆的受體蛋白并解析其下游效應(yīng)蛋白在抗感染先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S943
【部分圖文】：

華東理工大學(xué)碩士學(xué)位論文?第５頁(yè)??同上面兩種炎癥小體不同的是ＮＬＲＣ４受體由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，包括Ｎ端的ＣＡＲＤ，??中間的ＮＢＤ以及Ｃ端的ＬＲＲ。因?yàn)橛校茫粒遥慕Y(jié)構(gòu)域，而沒(méi)有ＰＹＤ結(jié)構(gòu)域，ＮＬＰＣ４炎??癥小體的組裝不需要接頭蛋白ＡＳＣ，但是在ＡＳＣ存在的情況能夠增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，同時(shí)??也有證據(jù)表明缺少ＡＳＣ后，ＮＬＲＣ４通過(guò)ＣＡＲＤ－ＣＡＲＤ相互作用招募ｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ－１，足??夠引發(fā)ｃａｓｐａｓｅ－１和ＧＳＤＭＤ引發(fā)的細(xì)胞焦亡，但是沒(méi)有ＩＬ－ｌｂ／ＩＬ－１８的成熟丨３７１。另外，??ＬＲＲ在ＮＬＲＣ４激活過(guò)程中起抑制作用，因?yàn)椋危蹋遥茫慈鄙儇�，ＲＲ結(jié)構(gòu)域后也能激活??ｃａｓｐａｓｅ－１。目前鑒定到ＮＬＲＣ４的激活劑有三種：細(xì)菌的鞭毛、三型分泌系統(tǒng)的通道蛋??白和基座蛋白［３８］。在ＮＬＲＣ４炎癥小體激活過(guò)程中，ＮＡ１Ｐ蛋白發(fā)揮著重要的功能，細(xì)菌??的鞭毛蛋白、三型分泌系統(tǒng)的通道蛋白和基座蛋白不能被ＮＬＲＣ４所識(shí)別，需要在ＮＡＩＰ??蛋白的幫助Ｆ形成復(fù)合體，使ＮＬＲＣ４的構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出來(lái)的ＣＡＲＤ結(jié)構(gòu)域與??ｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ－１相互作用，組裝成ＮＬＲＣ４炎癥小體使ｃａｓｐａｓｅ－丨成熟，引發(fā)下游的炎癥反??應(yīng)【３８，３９］。??

—ｉ??０?１０??圖２．４以ＡＪ法構(gòu)建的＊ＳｍＤＦＮＡ５進(jìn)化樹(shù)??Ｆｉｇ．?２．４?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ｏｆ?５７ＷＤＦＮＡ５?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ?ｂｙ?ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ?ｍｅｔｈｏｄ．??２．４．２大菱鲆ｃａｖ／＾ｙｅ－Ｊ基因的克隆??根據(jù)哺乳動(dòng)物和斑馬魚(yú)基因的序列比對(duì)信息，在序列保守序部分設(shè)計(jì)引??物，以大菱鲆的ｃＤＮＡ為模板獲得大菱鲆ｃａ■Ｓ７７ｍ？ｅ－Ｊ的保守序列，其大小為?５０４?ｂｐ（圖??２．７）。然后，通過(guò)５’?ＲＡＣＥ和３’?ＲＡＣＥ獲得該基因的未知片段，大小分別為３４７?ｂｐ和??６３３?ｂｐ?（圖?２．７）。??然后

２５０?ｂｐ??１〇〇?ｂｐ??圖２．３?ＤＦＮＡ５瓊脂糖凝膠電泳圖??Ｆｉｇ．?２．３?Ａｇａｒｏｓｅ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?．Ｓ，／ｗＤＦＮＡ５．??９９??Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ?ｏｉｉｖａｃｅｕｓ??７２?ｒ￣???Ａｎａｂａｓ?ｔｅｓｔｕｃｔｎｅｕｓ??６１廠?＾???Ｌａｔｅｓ?ｃａｌｃａｎｆｅｒ??５５???Ｍｏｎｏｐｔｅｒｕｓ?ａｌｂｕｓ??８３??—?ＬａｎｍｉｃｎｔＨｙｓ?ｃｒｏｃｅａ???ＡＳｃｏｐｈｔｈａ／ｍｕｓ?ｍａｘｉｍ?ｕｓ???ＭａｓｔａｃｅｍｂｅＪｕｓ?ａｒｗａｔｕｓ???Ｏｒｅｏｃｆｉｒｏｍｉｓ?ｒｕｌｏｔｉｃｕｓ???Ｔ〇Ｄ￣?Ｉ?Ｍｄｉｙｌｓｉｎｃｉａ?ｚｅｂｒａ??１００?１?Ｐｕｎｄａｍｔｌｉａ?ｎｙｅｒｅｒｅｉ??ｉ—ｉ??０?１０??圖２．４以ＡＪ法構(gòu)建的＊ＳｍＤＦＮＡ５進(jìn)化樹(shù)??Ｆｉｇ．?２．４?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ｏｆ?５７ＷＤＦＮＡ５?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ?ｂｙ?ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ?ｍｅｔｈｏｄ．??２．４．２大菱鲆ｃａｖ／＾ｙｅ－Ｊ基因的克隆??根據(jù)哺乳動(dòng)物和斑馬魚(yú)基因的序列比對(duì)信息，在序列保守序部分設(shè)計(jì)引??物，以大菱鲆的ｃＤＮＡ為模板獲得大菱鲆ｃａ■Ｓ７７ｍ？ｅ－Ｊ的保守序列，其大小為?５０４?ｂｐ（圖??２．７）。然后，通過(guò)５’?ＲＡＣＥ和３’?ＲＡＣＥ獲得該基因的未知片段，大小分別為３４７?ｂｐ和??６３３?ｂｐ?（圖?２．７）。??然后，經(jīng)過(guò)序列拼接得到大菱鲆基因全長(zhǎng)，其中?
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