發(fā)布時(shí)間：2020-11-18 00:26

　　 隨著集約化養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,有疾病防治和促進(jìn)生長(zhǎng)功能的抗生素類藥物和重金屬常作為飼料添加劑被廣泛應(yīng)用在畜禽醫(yī)療和養(yǎng)殖業(yè)中,其中以四環(huán)素類抗生素和重金屬銅的使用量最多�？股�素的廣泛使用和低效移除導(dǎo)致目前大量的抗生素持續(xù)輸出到水環(huán)境中。近年來,抗生素藥物在污水廠、地表水、地下水甚至飲用中都有檢出。高濃度抗生素一方面會(huì)對(duì)水生生物產(chǎn)生毒害作用,威脅水生生態(tài)系統(tǒng)的安全,另一方面,抗生素的長(zhǎng)期暴露會(huì)誘導(dǎo)生物體產(chǎn)生耐藥性,并對(duì)人類健康安全造成威脅。目前水體環(huán)境中殘存藥物的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)是國(guó)際研究的熱點(diǎn)。雖然抗生素的環(huán)境監(jiān)測(cè)已有不少文獻(xiàn)報(bào)道,但對(duì)于四環(huán)素類抗生素的環(huán)境效應(yīng)及機(jī)制研究并不多。環(huán)境中重金屬銅的濃度升高時(shí),一方面會(huì)直接對(duì)水生生物產(chǎn)生毒性效應(yīng),另一方面,當(dāng)抗生素同時(shí)存在時(shí),還會(huì)增加環(huán)境中抗性基因的豐度和傳播。目前對(duì)于四環(huán)素與銅的復(fù)合污染的環(huán)境效應(yīng)所知不多�；�于以上研究現(xiàn)狀,本論文選取斑馬魚為模式生物,以四環(huán)素和重金屬銅為研究對(duì)象,針對(duì)四環(huán)素、銅對(duì)斑馬魚胚胎的單一毒性效應(yīng)及機(jī)制進(jìn)行了研究,并對(duì)兩者的復(fù)合污染做了初步探索。第一部分內(nèi)容是應(yīng)用急性暴露實(shí)驗(yàn)、AO染色、RT-PCR等生物學(xué)方法,研究了四環(huán)素的水生毒理效應(yīng)。毒性效應(yīng)方面,四環(huán)素的96h急性暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明四環(huán)素(2-20,000μg/L)對(duì)斑馬魚胚胎的存活率無明顯影響,但四環(huán)素明顯抑制了斑馬魚胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育(p0.05),主要表現(xiàn)為孵化延遲、體長(zhǎng)變短、卵黃囊腫脹和魚鰾缺失等效應(yīng)。經(jīng)過分析得出四環(huán)素對(duì)斑馬魚胚胎96h的EC1o為3.16μg/L,低于實(shí)際環(huán)境濃度。在毒理機(jī)制研究方面,四環(huán)素暴露(10-200μg/L)導(dǎo)致幼魚的SOD和CAT基因的表達(dá)量明顯上調(diào),并且斑馬魚幼魚體內(nèi)ROS含量明顯上升(p0.05),說明四環(huán)素對(duì)斑馬魚的早期發(fā)育產(chǎn)生了氧化損傷。AO染色結(jié)果表明四環(huán)素(5,10,201μg/L)導(dǎo)致斑馬魚幼魚的尾部和心臟區(qū)域產(chǎn)生了細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果顯示四環(huán)素對(duì)斑馬魚胚胎產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡可能是由氧化應(yīng)激導(dǎo)致的,因此推測(cè)Caspase細(xì)胞凋亡信號(hào)通路可能是四環(huán)素誘導(dǎo)斑馬魚早期發(fā)育產(chǎn)生細(xì)胞凋亡的主要信號(hào)通路。另外,ABCC基因和藥物代謝基因(細(xì)胞色素p450)的表達(dá)結(jié)果顯示四環(huán)素可以誘導(dǎo)斑馬魚胚胎產(chǎn)生耐藥性。針對(duì)銅的水生毒理效應(yīng)研究,本文運(yùn)用了急性暴露實(shí)驗(yàn)(96h)來研究其對(duì)斑馬魚胚胎的毒性效應(yīng),結(jié)果顯示,銅具有明顯的致死和致畸效應(yīng),其對(duì)斑馬魚胚胎96h的LC1o為2.5 μg/L,EC1o為0.1μg/L。在表型效應(yīng)方面,銅(2.56-256 gg/L)抑制了斑馬魚胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育,表現(xiàn)為延遲了斑馬魚胚胎的孵化、卵黃囊吸收、頭部、魚鰾和體長(zhǎng)等生長(zhǎng)指標(biāo)的發(fā)育。在毒理機(jī)制的研究中,運(yùn)用了ICP-MS、RT-PCR和AO染色三種方法,數(shù)據(jù)表明,斑馬魚對(duì)不同濃度銅的相對(duì)吸收率隨著濃度的上升而下降,頭部對(duì)銅的富集程度要比軀干部位更明顯；RT-PCR數(shù)據(jù)表明,環(huán)境濃度的銅可能通過影響神經(jīng)和心臟相關(guān)基因的表達(dá)引起斑馬魚胚胎的神經(jīng)發(fā)育和心臟發(fā)育異常,但并未對(duì)MT基因產(chǎn)生顯著性變化。AO染色結(jié)果顯示銅導(dǎo)致斑馬魚幼魚心臟區(qū)域產(chǎn)生了細(xì)胞凋亡,同時(shí)還有少量的凋亡細(xì)胞集中在幼魚的尾部。最后一部分是對(duì)四環(huán)素和銅的復(fù)合污染的研究工作。首先,兩者96h持續(xù)聯(lián)合暴露的結(jié)果表明,與銅的單一毒性相比,在加入不同濃度的四環(huán)素(10-1000μg/L)后,存活率、孵化率、頭部發(fā)育和卵黃囊營(yíng)養(yǎng)吸收等指標(biāo)在不同程度上都有所緩解(p0.05)。ICP-MS的數(shù)據(jù)表明,四環(huán)素能明顯降低斑馬魚幼魚體內(nèi)的總銅含量(p0.05)。因此,我們推測(cè)兩者相互作用形成絡(luò)合物減少了斑馬魚胚胎吸收的銅含量,從而緩解了銅的毒性效應(yīng),這些結(jié)論表明了四環(huán)素和銅之間的復(fù)合污染類型屬于拮抗作用。綜合以上論述,本論文的研究結(jié)果表明,四環(huán)素對(duì)斑馬魚胚胎具有發(fā)育毒性,可以明顯抑制胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育。四環(huán)素對(duì)斑馬魚胚胎的毒性機(jī)制可能是通過形成ROS,對(duì)機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷,氧化損傷進(jìn)一步導(dǎo)致幼魚產(chǎn)生細(xì)胞凋亡,進(jìn)而抑制斑馬魚胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育。環(huán)境濃度的銅可能通過細(xì)胞凋亡、分子層面的變化等方式對(duì)斑馬魚的早期生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生危害,如延遲生長(zhǎng)發(fā)育和影響神經(jīng)和心臟發(fā)育,另外銅可通過和四環(huán)素等環(huán)境中其他污染物的結(jié)合降低銅離子的生物有效性和毒性。所有的這些數(shù)據(jù)和結(jié)論可以為抗生素和重金屬的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)以及環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)的制定提供一定的科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：X171.5
【部分圖文】：

環(huán)境中（Ｈｉｒｓｃｈｅｔａｌ．，?１９９９）。而低濃度的抗生素及其代謝產(chǎn)物在水體中不僅會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生??抗性基因（Ｂａｑｕｅｒｏ?ｅｔ?ａｌ．，?２００８），還會(huì)對(duì)水生生物及人類產(chǎn)生潛在的毒性效應(yīng)（Ｃｒａｎｅ?ｅｔ??ａｌ．，２００６）。水環(huán)境中抗生素的來源、遷移途徑和作用對(duì)象歸納見圖１?（章強(qiáng)等，２０１４）。??ｃｒＵ???抗生素生產(chǎn)??士?＼??工業(yè)廢水人類醫(yī)用養(yǎng)殖業(yè)??Ｉ?＼?？??？?類便??污水處理廠?Ｉ?１１１??Ｉ?土壤?人類??地表水飲用水?’??丄八丨關(guān)??水生生物?地下水沉積物??－?”?一?Ｉ?ｉ??圖１水環(huán)境中抗生素的來源與歸趨??Ｆｉｇ．?１?Ｓｏｕｒｃｅｓ?ａｎｄ?ｍｉｇｒａｔｉｏｎ?ｒｏｕｔｅｓ?ｏｆ?ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ?ｉｎ?ｗａｔｅｒ?ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ??２??

我國(guó)是抗生素使用大國(guó)，特別是在人口密度高、發(fā)展速度快的長(zhǎng)江三角洲地區(qū)。長(zhǎng)??江口水域的抗生素檢測(cè)開展的時(shí)間較遲，近年來，一些研宄者相繼檢測(cè)了上海市地表水??中抗生素的含量，表１總結(jié)了近年來上海市地區(qū)地表水中各類抗生素的含量，圖２為上??海水域的部分采樣點(diǎn)以及主要抗生素的組成情況（章強(qiáng)等，２０１４），可以看出長(zhǎng)江口主??要的抗生素是氯霉素類和磺胺類抗生素（Ｙａｎｅｔａｌ．，２０１３），氯霉素類中檢測(cè)濃度最高的??是甲砜霉素（表１），能達(dá)到ｌｌＯｎｇ／Ｌ擴(kuò)胺類中為磺胺卩比唆濃度最高，濃度為２１９ｎｇ幾。??Ｊｉａｎｇ等（２０１１）和沈群輝等（２０１２）的研究結(jié)果表明黃浦江污染較嚴(yán)重的是磺胺類和??四環(huán)素類抗生素。另外Ｊｉａｎｇ等（２０１１）于２０１１年針對(duì)黃浦江中抗生素的濃度進(jìn)行了季??節(jié)性的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)大部分抗生素的濃度冬季明顯比夏季高，其中橫胺類抗生素冬季的濃??度要比夏季高１－１０２倍，四環(huán)素類抗生素在夏季的總濃度（５．６１－６３．２６?ｎｇ／Ｌ）是冬季??（１９．１５－１４７．１５?ｎｇ／Ｌ）的一半，另外抗生素的檢出種類和頻率都呈現(xiàn)這種冬季高于夏季??的現(xiàn)象

表現(xiàn)出卵黃囊面積增加、魚標(biāo)缺失和體長(zhǎng)變短等畸形毒性效應(yīng)。其中在９６ｈｐｆ，對(duì)這些??不同表型在所有有效應(yīng)的胚胎和幼魚中所占的比例（圖４－Ｃ）和這些不同表型之間的相??關(guān)性（圖４－ｄ）進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)和記錄。其中，９６?ｈｐｆ的斑馬魚幼魚體長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖５－Ｃ??所示。在圖中可以得出，和對(duì)照組相比，所有的四環(huán)素濃度處理組都不能顯著改變斑馬??魚幼魚的體長(zhǎng)。在２０?ｉｉｇ／Ｌ四環(huán)素的處理組中，體長(zhǎng)變短的幼魚占總畸形總數(shù)的５２．５％，??說明，體長(zhǎng)發(fā)育是四環(huán)素影響斑馬魚胚胎發(fā)育的主要指標(biāo)之一。??在孵化方面，對(duì)照組中超過９８％的斑馬魚幼魚孵化成功（圖５－ｂ）。和對(duì)照組相比，??雖然低濃度四環(huán)素處理組的孵化率并沒有呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系（ｐ＜０．０５），但２００??ｐ＿ｇ／Ｌ以上濃度的四環(huán)素還是顯著的抑制了斑馬魚胚胎的蔣化，其中，２００＾１８／１＾處理組的??孵化率為９０．０?±０．２％超過５００ｔｎｇ／Ｌ后，沒有斑馬魚胚胎可以輝化成功（數(shù)據(jù)未給出）。??另外
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