發(fā)布時(shí)間：2020-11-12 12:03

　　 核黃素可通過生物合成、代謝等多個(gè)環(huán)節(jié),尤其是黃素介導(dǎo)的氧化還原過程,影響植物防衛(wèi)和生長發(fā)育。異源表達(dá)中華鱉核黃素受體蛋白轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)內(nèi)源核黃素含量高于野生型,同時(shí)轉(zhuǎn)基因植物也表現(xiàn)增強(qiáng)的抗病反應(yīng),但其機(jī)制不清楚。因此,本博士論文著重解析轉(zhuǎn)核黃素受體基因植物的抗病機(jī)制以及內(nèi)源核黃素含量調(diào)控所影響的生理過程和代謝途徑,為闡明核黃素參與調(diào)控植物生長和防衛(wèi)反應(yīng)的機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。生物脅迫與非生物脅迫影響植物的正常生長與發(fā)育,植物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的響應(yīng)稱為植物防衛(wèi)反應(yīng)。本文的研究目標(biāo)是鑒定參與調(diào)控植物防衛(wèi)反應(yīng)中新的因子。 1.核黃素受體蛋白調(diào)控?cái)M南芥過氧化氫(H2O2)信號(hào)及對(duì)病原細(xì)菌的防衛(wèi)反應(yīng) 核黃素(維生素B2)在生物體內(nèi)以黃素單核苷酸(flavin mononucleotide, FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)的形式作為輔基,與黃素蛋白(flavoprotein)或金屬黃素蛋白(metalloflavoprotein)組成復(fù)合酶,參與生物體內(nèi)以氧化-還原反應(yīng)為特征的五十多個(gè)生理生化過程。我們的研究表明,核黃素在擬南芥體內(nèi)引發(fā)H2O2信號(hào),調(diào)控對(duì)病原細(xì)菌的抗性。為了調(diào)控植物體內(nèi)核黃素的含量,我們通過轉(zhuǎn)基因手段,在擬南芥過量表達(dá)中華鱉(Trionyx sinensis japonicus)的核黃素受體(riboflavin receptor)基因,得到轉(zhuǎn)基因擬南芥品系RIRA11 (riboflavin receptor expression Arabidopsis)。擬南芥轉(zhuǎn)基因植株(RIRA11)與野生型相比,在營養(yǎng)生長期間,體內(nèi)核黃素含量增加、黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)含量降低,增強(qiáng)對(duì)病原細(xì)菌的抗性。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明,轉(zhuǎn)基因擬南芥(RIRA11)中涉及多個(gè)細(xì)胞進(jìn)程的950個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生了改變。其中線粒體電子傳遞有關(guān)的13個(gè)基因表達(dá)顯著下降,導(dǎo)致植株體內(nèi)H2O2含量上升；RT-PCR和real-time PCR分析表明,此13個(gè)基因表達(dá)水平與芯片數(shù)據(jù)一致。轉(zhuǎn)基因植株中核黃素受體基因沉默后,其黃素含量和抗病表型回復(fù)到野生型的表型。我們的研究表明,通過調(diào)控增加植物體內(nèi)黃素含量,抑制線粒體電子傳遞鏈基因表達(dá),促進(jìn)H2O2的產(chǎn)生,這些細(xì)胞生理代謝的變化,最后導(dǎo)致植物體內(nèi)H2O2含量增加,增強(qiáng)植物抗病性。 2.外源核黃素受體蛋白調(diào)控?cái)M南芥開花轉(zhuǎn)型 核黃素可通過生物合成、代謝等多個(gè)環(huán)節(jié),尤其是黃素介導(dǎo)的氧化還原過程,影響植物防衛(wèi)和生長發(fā)育。我們把中華鱉的核黃素受體基因轉(zhuǎn)入擬南芥中,借以調(diào)控植物體內(nèi)的黃素含量,研究黃素對(duì)于植物防衛(wèi)與生長發(fā)育的調(diào)控作用。異源表達(dá)核黃素受體蛋白擬南芥品系RIRA11 (riboflavin receptor expression Arabidopsis)體內(nèi)總的黃素含量增加,線粒體電子傳遞鏈主要基因轉(zhuǎn)錄水平下降,細(xì)胞氧化還原水平上升,開花提前。用RNAi方法沉默轉(zhuǎn)基因植株中的外源核黃素受體基因后,沉默植物恢復(fù)到野生型的表型。與野生型或基因沉默植株相比,過量表達(dá)核黃素受體擬南芥(RIRA11)開花轉(zhuǎn)型相關(guān)基因表達(dá)增強(qiáng),頂端分生組織中開花標(biāo)志基因AP1表達(dá)增強(qiáng),開花提前。外源施用H202能誘導(dǎo)植物開花,但依賴于植株體內(nèi)H2O2含量。我們的研究表明,過量表達(dá)核黃素受體擬南芥開花提前,H2O2在植物開花轉(zhuǎn)型過程中起重要作用。 3.晝夜節(jié)律調(diào)控?cái)M南芥核黃素信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng) 植物晝夜節(jié)律鐘在調(diào)控植物生理進(jìn)程、對(duì)環(huán)境的響應(yīng)和發(fā)育中起及其重要的作用。與此相似,核黃素信號(hào)途徑廣泛參與調(diào)控植物生長與發(fā)育。核黃素是黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的前體。FMN, FAD是生物體黃素酶輔基,參與植物體內(nèi)線粒體電子傳遞、光合作用、脂肪酸氧化、維生素B6、維生素B12、葉酸代謝等多個(gè)生化過程。本研究中,我們的研究結(jié)果表明,植物晝夜節(jié)律調(diào)控核黃素信號(hào)傳導(dǎo)途徑。我們通過異源表達(dá)中華鱉核黃素受體蛋白的擬南芥,來調(diào)控植物內(nèi)源核黃素含量。異源表達(dá)核黃素受體擬南芥和野生型相似,內(nèi)源核黃素含量在24 h周期內(nèi)呈節(jié)律波動(dòng),但異源表達(dá)核黃素受體擬南芥植株內(nèi)源核黃素含量顯著高于野生型植株。RT-PCR分析結(jié)果表明,植物內(nèi)源核黃素含量升高影響了晝夜節(jié)律鐘輸入途徑和中心震蕩器有關(guān)基因的表達(dá)模式。另外,外源核黃素誘導(dǎo)或抑制基因的表達(dá)模式也受晝夜節(jié)律調(diào)控。外源核黃素施用植物能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng),該過程也受晝夜節(jié)律調(diào)控。因此,我們的研究表明,植物晝夜節(jié)律鐘調(diào)控核黃素信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)。 4.擬南芥RIR類似蛋白(AtRIR)在非生物脅迫中的功能分析 滲透壓、氧和鹽等非生物脅迫影響植物的正常生長和發(fā)育。在非生物脅迫環(huán)境下植物體內(nèi)產(chǎn)生、積累的活性氧對(duì)植物造成了氧脅迫。AtRIR (At5G27830)是一個(gè)功能未知蛋白,序列推測可能是核黃素受體(RIR)類似蛋白。RT-PCR和AtRIR啟動(dòng)子控制的GUS活性檢測表明,AtRIR在植物所有主要器官包括根、莖、葉、花中表達(dá)。通過根長測定表明,與野生型擬南芥相比,AtRIR T-DNA插入突變體對(duì)滲透壓、氧和鹽脅迫更敏感；過量表達(dá)AtRIR轉(zhuǎn)基因擬南芥(AtRIR-OE)增強(qiáng)對(duì)滲透壓、氧脅迫的抗性。轉(zhuǎn)基因植株在鹽、氧、滲透壓脅迫和脫落酸處理下,與野生型相比,體內(nèi)活性氧的含量降低,氧脅迫反應(yīng)基因(APX1和FSD1)表達(dá)減弱；但非生物脅迫反應(yīng)基因(COR47, RD29B, RD29A)表達(dá)增強(qiáng)。這些研究表明,AtRIR通過調(diào)控植物體內(nèi)活性氧的含量,介導(dǎo)植物對(duì)非生物脅迫的抗性。 5.擬南芥RAP2.6L轉(zhuǎn)錄因子突變體增強(qiáng)對(duì)Pseudomonas syringae的抗性 植物受病原菌侵染或用病原物激發(fā)子處理植物時(shí),激活的植物防衛(wèi)反應(yīng)中涉及大量基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。目前許多研究表明,ERF類轉(zhuǎn)錄因子在植物受病原物侵染后,通過調(diào)控寄主植物基因的表達(dá)參與植物防衛(wèi)反應(yīng)。然而,特異的ERF轉(zhuǎn)錄因子在植物防衛(wèi)中的作用還知之甚少。我們分析了RAP2.6L轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥對(duì)Pst DC3000基本防衛(wèi)中的作用。RAP2.6L偶聯(lián)GFP的融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞中定位于細(xì)胞核。RAP2.6L受環(huán)境脅迫(水楊酸、茉莉酸、黃酮)的誘導(dǎo)表達(dá)。通過分析RAP2.6L在基本防衛(wèi)信號(hào)通路突變abi1-1, jar1-1, ein2-1和npr1-1上的受病原細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)模式,表明水楊酸和茉莉酸信號(hào)通路正調(diào)控RAP2.6L表達(dá),而乙烯信號(hào)通路抑制其表達(dá)。RAP2.6L T-DNA插入突變體rap2.6L接種Pst DC3000后,與野生型相比,3d后葉片細(xì)菌數(shù)量減少約10倍,病害癥狀顯著減輕,水楊酸調(diào)控的PR1, PR2基因表達(dá)增強(qiáng)�；�于rap2.6L突變體的分析表明,RAP2.6L負(fù)調(diào)控植物對(duì)Pst DC3000的基本防衛(wèi)反應(yīng)。RAP2.6L具有轉(zhuǎn)錄激活功能,在植物防衛(wèi)反應(yīng)中調(diào)控了許多下游因子,參與植物對(duì)病原細(xì)菌的抗性。 總結(jié) 本研究利用核黃素受體蛋白轉(zhuǎn)基因擬南芥為主要研究材料,對(duì)內(nèi)源核黃素變化對(duì)于植物防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制及其開花轉(zhuǎn)型進(jìn)行了解析。本文還對(duì)鑒定了調(diào)控?cái)M南芥防衛(wèi)反應(yīng)的兩個(gè)因子。研究發(fā)現(xiàn)：第一,核黃素受體轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)核黃素含量升高,轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析影響了次級(jí)代謝、物質(zhì)運(yùn)輸、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種生理代謝過程。核黃素通過抑制線粒體電子傳遞鏈基因表達(dá),致使植株內(nèi)源過氧化氫水平升高。第二,過氧化氫是擬南芥防衛(wèi)的重要信號(hào)分子,抑制植物過氧化氫含量同時(shí)也削弱了植物的防衛(wèi)能力。過氧化氫介導(dǎo)核黃素受體轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)病原細(xì)菌的抗性。第三,核黃素受體蛋白轉(zhuǎn)基因擬南芥開花提前,過氧化氫在此過程中起重要作用,體外施用過氧化氫能誘導(dǎo)擬南芥提前開花。第四,野生型擬南芥葉片中核黃素含量受光周期調(diào)控,晝夜節(jié)律調(diào)控核黃素信號(hào)傳導(dǎo)。第五,鑒定了AtRIR在擬南芥抗非生物脅迫中的作用。第六,擬南芥RAP2.6L T-DNA突變體增強(qiáng)對(duì)病原細(xì)菌的抗性。
【學(xué)位單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：S432.1
【部分圖文】：

modifiedtranseriPtionalgenesProfile.(B)Overviewofthedifferentiallyalteredgenesencoding transcriPtionfaetors.對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥RIRAll中表達(dá)顯著變化的基因作分類研究(圖1一3)，結(jié)果表明RIRAll中對(duì)線蟲反應(yīng) (responsetonematode)，對(duì)茉莉酸反應(yīng) (responsetojasmo垃 eaeidstimulate)

2.3轉(zhuǎn)基因擬南芥RIRA線粒體電子傳遞鏈基因表達(dá)受抑制，導(dǎo)致葉片過氧化氫(玩02)含量增加根據(jù)芯片數(shù)據(jù)(圖1一4A)，班RAn線粒體電子傳遞鏈下調(diào)的基因?yàn)?3個(gè)(變化倍數(shù)蕊0.5)，另外有4個(gè)基因變化倍數(shù)在0.5一0.7之間。其中，位于復(fù)合體I上有四個(gè)，均為NADH一泛醒氧化還原酶相關(guān)基因;位于復(fù)合體111上有3個(gè)，為輔酶Q一細(xì)胞色素bcl還原酶基因;另外兩個(gè)分別為p產(chǎn)idine皿cleotide一 disulphideoxidoreductasefarnilyProtein和位于復(fù)合體W上的細(xì)胞色素氧化酶蛋白家族。而且，參與AfP合成的四個(gè)蛋白基因也被抑制。線粒體ETC的4種復(fù)合物中，復(fù)合體I和復(fù)合體111是產(chǎn)生ROS部位(Moller

受體蛋白(獄R)與RIR類似蛋白(AIRIR)以及轉(zhuǎn)錄因子RAp2.6L在擬南芥防衛(wèi)反應(yīng)中的功能研究都有很強(qiáng)的與核黃素結(jié)合的生物活性(圖2一IC)，能顯著降低核黃素的熒光強(qiáng)度，核黃素中加入核黃素受體蛋白(RIR)后熒光值從 421.6降低到54.2(圖2一IC)，這表明我們在從中華鱉中克隆的核黃素受體蛋白是有結(jié)合核黃素的生物學(xué)功能。在擬南芥(Col一0)背景中用355啟動(dòng)子過量表達(dá)中華鱉核黃素受體蛋白，得到轉(zhuǎn)基因品系RIRAll。Northem雜交 (RNAgelblot)表明，租RAll組成性過量表達(dá)核黃素受體基因(第1章)。為了明確轉(zhuǎn)基因植株的表型是由過量表達(dá)外源核黃素受體蛋白引起的，我們在轉(zhuǎn)基因品系RIRA背景中，轉(zhuǎn)入反向重復(fù)的核黃素受體基因片段單元，利用基因沉默(RNAI)的原理沉默mRA中外源的核黃素受體基因的表達(dá)。于是我們在RIRA背景中得到外源核黃素受體基因沉默植株，并命名位SIRn(園ence班RA旦)。從基因沉默植株SIRn提取的蛋白
【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2880724