發(fā)布時間：2020-11-12 12:03

　　 核黃素可通過生物合成、代謝等多個環(huán)節(jié),尤其是黃素介導的氧化還原過程,影響植物防衛(wèi)和生長發(fā)育。異源表達中華鱉核黃素受體蛋白轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)內(nèi)源核黃素含量高于野生型,同時轉(zhuǎn)基因植物也表現(xiàn)增強的抗病反應,但其機制不清楚。因此,本博士論文著重解析轉(zhuǎn)核黃素受體基因植物的抗病機制以及內(nèi)源核黃素含量調(diào)控所影響的生理過程和代謝途徑,為闡明核黃素參與調(diào)控植物生長和防衛(wèi)反應的機制提供研究基礎(chǔ)。生物脅迫與非生物脅迫影響植物的正常生長與發(fā)育,植物對生物脅迫和非生物脅迫的響應稱為植物防衛(wèi)反應。本文的研究目標是鑒定參與調(diào)控植物防衛(wèi)反應中新的因子。 1.核黃素受體蛋白調(diào)控擬南芥過氧化氫(H2O2)信號及對病原細菌的防衛(wèi)反應 核黃素(維生素B2)在生物體內(nèi)以黃素單核苷酸(flavin mononucleotide, FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)的形式作為輔基,與黃素蛋白(flavoprotein)或金屬黃素蛋白(metalloflavoprotein)組成復合酶,參與生物體內(nèi)以氧化-還原反應為特征的五十多個生理生化過程。我們的研究表明,核黃素在擬南芥體內(nèi)引發(fā)H2O2信號,調(diào)控對病原細菌的抗性。為了調(diào)控植物體內(nèi)核黃素的含量,我們通過轉(zhuǎn)基因手段,在擬南芥過量表達中華鱉(Trionyx sinensis japonicus)的核黃素受體(riboflavin receptor)基因,得到轉(zhuǎn)基因擬南芥品系RIRA11 (riboflavin receptor expression Arabidopsis)。擬南芥轉(zhuǎn)基因植株(RIRA11)與野生型相比,在營養(yǎng)生長期間,體內(nèi)核黃素含量增加、黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)含量降低,增強對病原細菌的抗性。轉(zhuǎn)錄組學分析表明,轉(zhuǎn)基因擬南芥(RIRA11)中涉及多個細胞進程的950個基因的表達發(fā)生了改變。其中線粒體電子傳遞有關(guān)的13個基因表達顯著下降,導致植株體內(nèi)H2O2含量上升；RT-PCR和real-time PCR分析表明,此13個基因表達水平與芯片數(shù)據(jù)一致。轉(zhuǎn)基因植株中核黃素受體基因沉默后,其黃素含量和抗病表型回復到野生型的表型。我們的研究表明,通過調(diào)控增加植物體內(nèi)黃素含量,抑制線粒體電子傳遞鏈基因表達,促進H2O2的產(chǎn)生,這些細胞生理代謝的變化,最后導致植物體內(nèi)H2O2含量增加,增強植物抗病性。 2.外源核黃素受體蛋白調(diào)控擬南芥開花轉(zhuǎn)型 核黃素可通過生物合成、代謝等多個環(huán)節(jié),尤其是黃素介導的氧化還原過程,影響植物防衛(wèi)和生長發(fā)育。我們把中華鱉的核黃素受體基因轉(zhuǎn)入擬南芥中,借以調(diào)控植物體內(nèi)的黃素含量,研究黃素對于植物防衛(wèi)與生長發(fā)育的調(diào)控作用。異源表達核黃素受體蛋白擬南芥品系RIRA11 (riboflavin receptor expression Arabidopsis)體內(nèi)總的黃素含量增加,線粒體電子傳遞鏈主要基因轉(zhuǎn)錄水平下降,細胞氧化還原水平上升,開花提前。用RNAi方法沉默轉(zhuǎn)基因植株中的外源核黃素受體基因后,沉默植物恢復到野生型的表型。與野生型或基因沉默植株相比,過量表達核黃素受體擬南芥(RIRA11)開花轉(zhuǎn)型相關(guān)基因表達增強,頂端分生組織中開花標志基因AP1表達增強,開花提前。外源施用H202能誘導植物開花,但依賴于植株體內(nèi)H2O2含量。我們的研究表明,過量表達核黃素受體擬南芥開花提前,H2O2在植物開花轉(zhuǎn)型過程中起重要作用。 3.晝夜節(jié)律調(diào)控擬南芥核黃素信號傳導反應 植物晝夜節(jié)律鐘在調(diào)控植物生理進程、對環(huán)境的響應和發(fā)育中起及其重要的作用。與此相似,核黃素信號途徑廣泛參與調(diào)控植物生長與發(fā)育。核黃素是黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的前體。FMN, FAD是生物體黃素酶輔基,參與植物體內(nèi)線粒體電子傳遞、光合作用、脂肪酸氧化、維生素B6、維生素B12、葉酸代謝等多個生化過程。本研究中,我們的研究結(jié)果表明,植物晝夜節(jié)律調(diào)控核黃素信號傳導途徑。我們通過異源表達中華鱉核黃素受體蛋白的擬南芥,來調(diào)控植物內(nèi)源核黃素含量。異源表達核黃素受體擬南芥和野生型相似,內(nèi)源核黃素含量在24 h周期內(nèi)呈節(jié)律波動,但異源表達核黃素受體擬南芥植株內(nèi)源核黃素含量顯著高于野生型植株。RT-PCR分析結(jié)果表明,植物內(nèi)源核黃素含量升高影響了晝夜節(jié)律鐘輸入途徑和中心震蕩器有關(guān)基因的表達模式。另外,外源核黃素誘導或抑制基因的表達模式也受晝夜節(jié)律調(diào)控。外源核黃素施用植物能誘導植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應,該過程也受晝夜節(jié)律調(diào)控。因此,我們的研究表明,植物晝夜節(jié)律鐘調(diào)控核黃素信號傳導反應。 4.擬南芥RIR類似蛋白(AtRIR)在非生物脅迫中的功能分析 滲透壓、氧和鹽等非生物脅迫影響植物的正常生長和發(fā)育。在非生物脅迫環(huán)境下植物體內(nèi)產(chǎn)生、積累的活性氧對植物造成了氧脅迫。AtRIR (At5G27830)是一個功能未知蛋白,序列推測可能是核黃素受體(RIR)類似蛋白。RT-PCR和AtRIR啟動子控制的GUS活性檢測表明,AtRIR在植物所有主要器官包括根、莖、葉、花中表達。通過根長測定表明,與野生型擬南芥相比,AtRIR T-DNA插入突變體對滲透壓、氧和鹽脅迫更敏感；過量表達AtRIR轉(zhuǎn)基因擬南芥(AtRIR-OE)增強對滲透壓、氧脅迫的抗性。轉(zhuǎn)基因植株在鹽、氧、滲透壓脅迫和脫落酸處理下,與野生型相比,體內(nèi)活性氧的含量降低,氧脅迫反應基因(APX1和FSD1)表達減弱；但非生物脅迫反應基因(COR47, RD29B, RD29A)表達增強。這些研究表明,AtRIR通過調(diào)控植物體內(nèi)活性氧的含量,介導植物對非生物脅迫的抗性。 5.擬南芥RAP2.6L轉(zhuǎn)錄因子突變體增強對Pseudomonas syringae的抗性 植物受病原菌侵染或用病原物激發(fā)子處理植物時,激活的植物防衛(wèi)反應中涉及大量基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。目前許多研究表明,ERF類轉(zhuǎn)錄因子在植物受病原物侵染后,通過調(diào)控寄主植物基因的表達參與植物防衛(wèi)反應。然而,特異的ERF轉(zhuǎn)錄因子在植物防衛(wèi)中的作用還知之甚少。我們分析了RAP2.6L轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥對Pst DC3000基本防衛(wèi)中的作用。RAP2.6L偶聯(lián)GFP的融合蛋白在洋蔥表皮細胞中定位于細胞核。RAP2.6L受環(huán)境脅迫(水楊酸、茉莉酸、黃酮)的誘導表達。通過分析RAP2.6L在基本防衛(wèi)信號通路突變abi1-1, jar1-1, ein2-1和npr1-1上的受病原細菌誘導表達模式,表明水楊酸和茉莉酸信號通路正調(diào)控RAP2.6L表達,而乙烯信號通路抑制其表達。RAP2.6L T-DNA插入突變體rap2.6L接種Pst DC3000后,與野生型相比,3d后葉片細菌數(shù)量減少約10倍,病害癥狀顯著減輕,水楊酸調(diào)控的PR1, PR2基因表達增強�；�于rap2.6L突變體的分析表明,RAP2.6L負調(diào)控植物對Pst DC3000的基本防衛(wèi)反應。RAP2.6L具有轉(zhuǎn)錄激活功能,在植物防衛(wèi)反應中調(diào)控了許多下游因子,參與植物對病原細菌的抗性。 總結(jié) 本研究利用核黃素受體蛋白轉(zhuǎn)基因擬南芥為主要研究材料,對內(nèi)源核黃素變化對于植物防衛(wèi)反應信號傳導機制及其開花轉(zhuǎn)型進行了解析。本文還對鑒定了調(diào)控擬南芥防衛(wèi)反應的兩個因子。研究發(fā)現(xiàn)：第一,核黃素受體轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)核黃素含量升高,轉(zhuǎn)錄組學分析影響了次級代謝、物質(zhì)運輸、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種生理代謝過程。核黃素通過抑制線粒體電子傳遞鏈基因表達,致使植株內(nèi)源過氧化氫水平升高。第二,過氧化氫是擬南芥防衛(wèi)的重要信號分子,抑制植物過氧化氫含量同時也削弱了植物的防衛(wèi)能力。過氧化氫介導核黃素受體轉(zhuǎn)基因擬南芥對病原細菌的抗性。第三,核黃素受體蛋白轉(zhuǎn)基因擬南芥開花提前,過氧化氫在此過程中起重要作用,體外施用過氧化氫能誘導擬南芥提前開花。第四,野生型擬南芥葉片中核黃素含量受光周期調(diào)控,晝夜節(jié)律調(diào)控核黃素信號傳導。第五,鑒定了AtRIR在擬南芥抗非生物脅迫中的作用。第六,擬南芥RAP2.6L T-DNA突變體增強對病原細菌的抗性。
【學位單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：S432.1
【部分圖文】：

modifiedtranseriPtionalgenesProfile.(B)Overviewofthedifferentiallyalteredgenesencoding transcriPtionfaetors.對轉(zhuǎn)基因擬南芥RIRAll中表達顯著變化的基因作分類研究(圖1一3)，結(jié)果表明RIRAll中對線蟲反應 (responsetonematode)，對茉莉酸反應 (responsetojasmo垃 eaeidstimulate)

2.3轉(zhuǎn)基因擬南芥RIRA線粒體電子傳遞鏈基因表達受抑制，導致葉片過氧化氫(玩02)含量增加根據(jù)芯片數(shù)據(jù)(圖1一4A)，班RAn線粒體電子傳遞鏈下調(diào)的基因為13個(變化倍數(shù)蕊0.5)，另外有4個基因變化倍數(shù)在0.5一0.7之間。其中，位于復合體I上有四個，均為NADH一泛醒氧化還原酶相關(guān)基因;位于復合體111上有3個，為輔酶Q一細胞色素bcl還原酶基因;另外兩個分別為p產(chǎn)idine皿cleotide一 disulphideoxidoreductasefarnilyProtein和位于復合體W上的細胞色素氧化酶蛋白家族。而且，參與AfP合成的四個蛋白基因也被抑制。線粒體ETC的4種復合物中，復合體I和復合體111是產(chǎn)生ROS部位(Moller

受體蛋白(獄R)與RIR類似蛋白(AIRIR)以及轉(zhuǎn)錄因子RAp2.6L在擬南芥防衛(wèi)反應中的功能研究都有很強的與核黃素結(jié)合的生物活性(圖2一IC)，能顯著降低核黃素的熒光強度，核黃素中加入核黃素受體蛋白(RIR)后熒光值從 421.6降低到54.2(圖2一IC)，這表明我們在從中華鱉中克隆的核黃素受體蛋白是有結(jié)合核黃素的生物學功能。在擬南芥(Col一0)背景中用355啟動子過量表達中華鱉核黃素受體蛋白，得到轉(zhuǎn)基因品系RIRAll。Northem雜交 (RNAgelblot)表明，租RAll組成性過量表達核黃素受體基因(第1章)。為了明確轉(zhuǎn)基因植株的表型是由過量表達外源核黃素受體蛋白引起的，我們在轉(zhuǎn)基因品系RIRA背景中，轉(zhuǎn)入反向重復的核黃素受體基因片段單元，利用基因沉默(RNAI)的原理沉默mRA中外源的核黃素受體基因的表達。于是我們在RIRA背景中得到外源核黃素受體基因沉默植株，并命名位SIRn(園ence班RA旦)。從基因沉默植株SIRn提取的蛋白
【引證文獻】

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1 王麗萍;砧用南瓜提高黃瓜嫁接苗耐鹽性的生理機制及蛋白質(zhì)組學研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2012年

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 田雙梅;轉(zhuǎn)錄因子AtMYB44促進擬南芥抗病耐熱及抑制開花的作用[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2012年

本文編號：2880724