嗜酸乳桿菌是乳酸菌中重要成員之一,在粘附宿主腸道細(xì)胞、與致病菌競爭粘附位點(diǎn)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能上發(fā)揮著重要作用。作為粘附因子的S-層蛋白,受到越來越多學(xué)者的關(guān)注與研究。隨著基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展,研究者從S-層蛋白的蛋白分子層面深入研究到了基因分子層面。研究表明嗜酸乳桿菌還有另外一個(gè)S-層蛋白基因slpB,與slpA基因不同的地方slpB屬于沉默基因,對于基因slpB研究報(bào)道很少,對于其是否具有粘附功能還需要進(jìn)一步探索。本課題的主要研究方法與結(jié)果如下:1、以提取的嗜酸乳桿菌全基因組為模板成功克隆出slpB基因,條帶大小接近1300 bp,與NCBI報(bào)道L.acidophilus NCFM基因庫中slpB基因大小一致。構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-slpB,經(jīng)過雙酶切驗(yàn)證,得到約1300 bp的目的片段和約5400 bp的載體片段,與預(yù)測值相符。測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果正確。2、對構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28a-slpB進(jìn)行了表達(dá),確定了目的蛋白上清表達(dá)高于沉淀表達(dá)。通過控制變量法得到了最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件:誘導(dǎo)溫度37℃、IPTG終濃度1mM、誘導(dǎo)時(shí)間14h。通過目的蛋白上的His-... 

【文章來源】：南京師范大學(xué)江蘇省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２．１?ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）質(zhì)粒構(gòu)型圖??Ｆｉｇｕｒｅ?２．１?Ｃｏｎｓｔｒｕｃ?

２．３實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析??２３．１辦５基因的克隆??將提取的嗜酸乳桿菌全基因組進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，見左圖２．２Ａ。如圖所??示，提取的ＤＮＡ條帶單一，說明提取出的基因組片段較完整，無明顯降解片段，可??進(jìn)行后續(xù)基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。??以提取的嗜酸乳桿菌ＮＣＦＭ全基因組為模板，Ｐｌ、Ｐ２為引物特異性擴(kuò)增功？５基??因，如圖２．２Ｂ所示，條帶大小接近１３００?ｂｐ，與ＮＣＢＩ報(bào)道Ｌ?ｃｒｄｔ／ｏｐＭｗｓ?ＮＣＦＭ基因??庫中基因大小一致。??１?Ｍ?Ｍｌ??Ｉ??１９３２９ｂｐ?ｉ????６２２３?ｂｐ??｜｜ＢＳ｜?１５００?ｂｐ????ｌｏｏｏ?ｔ＞ｐ?——??ａ?ｂ??圖２．２全基因組ＤＮＡ與ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果??Ｆｉｇｕｒｅ?２．２?Ｔｏｔａｌ?ＤＮＡ?ｏｆ?ＮＣＦＭ?ａｎｄ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔ??１９??

Ｍ：空載?ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）；?１：重組質(zhì)粒?ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）－ｓｌｐＢ??連接好的重組質(zhì)粒經(jīng)過轉(zhuǎn)化、涂布、培養(yǎng)、藍(lán)白斑篩選、菌落ＰＣＲ鑒定，最后??提取質(zhì)粒如圖２．４所示，重組質(zhì)粒ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）－ｓｌｐＢ條帶明顯高于空載??ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ；），可初步判定有基因片段己連接到Ｔ載體上，是否是目的片段還需??要相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切驗(yàn)證。??２．３．３重組質(zhì)粒ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）－ｓｌｐＢ雙酶切驗(yàn)證??重組質(zhì)粒ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）－ｓｌｐＢ經(jīng)Ｎｄｅｌ與Ｘｈｏｌ雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳檢??測，如圖２．５所示，重組質(zhì)粒雙酶切后得到大小約為１３００?ｂｐ的片段，與理論值相符，??說明重組質(zhì)粒ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）－ｓｌｐＢ構(gòu)建成功。將小量酶切驗(yàn)證有目的基因條帶的重??組質(zhì)粒樣品送至上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果與ＮＣＢＩ數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比??對，如圖２．６所示：擴(kuò)增的１２９９?ｂｐ與數(shù)據(jù)庫信息完全一致。將比對完全正確的重組??質(zhì)粒進(jìn)行保存。??１?Ｍ??Ｉ一?２０００?ｂｐ??＇—?１０００?ｂｐ??Ｉ??圖２．５重組質(zhì)粒ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ＞ｓｌｐＢ酶切驗(yàn)證??Ｆｉｇｕｒｅ?２．５?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）－ｓｌｐＢ?ｂｙ?ｒｅ


本文編號：2909806